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传统培养方法从环境中只能获得1%左右的微生物,极大限制了人类对微生物遗传资源的有效利用。现代生物科技以及严峻的能源危机对新型工业用酶的需求日益旺盛,极大的促进了新型开发环境遗传资源技术手段的发展。而元基因组技术作为一种不依赖于培养的新理念和新方法,可以克服上述瓶颈,使从探究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实。
本研究的目的是从深海沉积物微生物元基因组文库中克隆新的酯酶基因,并进行酶学性质研究。本研究中,我们利用含有三丁酸甘油酯的酯酶选择性筛选培养基,从深海沉积物微生物元基因组文库中筛选得到酯酶阳性Fosmid克隆。对筛选得到的fosmid FL10进行部分酶切构建亚克隆文库,筛选得到酯酶阳性亚克隆pFLS10。PCR扩增目的片段后与pET28a连接构建酯酶基因原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。纯化表达产物并对其进行活性测定及酶学性质研究。序列分析显示该pFLS10亚克隆质粒含有一段924 bp的ORF(OpenReading Frame),与-海洋元基因组文库中筛选出的酯酶ADA70030序列一致性为71%。该酶为-新的低温酯酶,对C4底物(对硝基苯丁酸酯)水解能力最强。该酶最适作用温度为20℃,最适作用pH为7.5,20℃时较为稳定,pH8-10的范围内有良好的pH稳定性,K+、Mg2+对该酶具有一定的激活作用,Mn2+等对其具有不同程度的抑制作用。应用元基因组技术筛选到了新的酯酶基因fls10并进行了克隆表达,该酶在低温及碱性条件下较为稳定且活力较高,对于工业化生产具有一定的应用潜力。
从环境中发掘重要的工业用酶用于工业应用,有利于节约原材料、节省能源,对于促进工业化发展和经济增长具有重要意义,同时也为开发海洋微生物的其它重要功能基因提供有力借鉴,为寻求海洋微生物资源最大限度挖掘、可持续开发利用的科学途径奠定理论基础。