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microRNAs是由21—25个核苷酸组成的非编码RNA,它通过与靶基因的3’-UTR的配对,促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达,近年来,其与各种疾病的关系的研究成为热点。2型糖尿病作为一种代谢性疾病,大量研究工作集中于2型糖尿病编码蛋白的易感基因筛查和功能的鉴定,关于microRNAs与此疾病的关系知之甚少。本实验以国际上公认的2型糖尿病模型——Goto-Kakizaki大鼠为实验对象,用microRNAs芯片筛查GK大鼠与健康对照Wistar大鼠的骨骼肌中差异表达的microRNAs。设定阀值1.5倍,SAM软件分析找到15个差异表达的microRNAs,与健康对照组比较,其中上调的有4个(miR-29a、miR-29b、miR-29c和miR-150),下调的有11个(miR-379、miR-127、miR-299-5p、miR-434-3p、miR-335、miR-130a、miR-19b、miR-451、miR-148a、miR-199a和miR-152)。Northern杂交验证结果为,表达丰度较高的上调的四个microRNAs与芯片结果完全一致,下调的microRNAs中,如miR-152丰度较低,且与芯片结果不一致,其表达量在两组间没有差异;miR-130a、miR-19b和miR-434-3p与芯片结果一致,而其他下调的microRNAs则可能因丰度甚低,Northern杂交没有检测到信号。依据高胰岛素和高葡萄糖是2型糖尿病最典型的特征,我们在3T3-L1脂肪细胞中,以高胰岛素联合高葡萄糖处理细胞24小时后,发现miR-29a和miR-29b的表达增加,而48小时后仅miR-29b的表达差异显著,说明高胰岛素和高葡萄糖是miR-29表达上调的一个诱因,但可能还有其他因素的作用。接着用腺病毒为载体高量表达miR-29,结果显示,胰岛素刺激葡萄糖吸收的增加受到抑制(50%),而这种抑制作用可被miR-29的抑制剂处理细胞部分抵消,使上述抑制效率从50%降低至24%。免疫荧光的结果表明,过表达miR-29使得胰岛素诱导的GLUT4向细胞膜上的转运受到了抑制。同时与高胰岛素高葡萄糖作用于3T3-L1脂肪细胞产生的胰岛素抵抗效应一样,Akt的激活也受到抑制,虽然miR-29所产生的抑制程度不及后者显著,但是综合前面的结果我们可以得出miR-29的过量表达在细胞水平上能产生胰岛素抵抗效应。测序分析miR-29的前体序列发现,仅miR-29b2的前体序列有2个核苷酸的多态性,且位于前体的茎环结构区,但是克隆表达GK大鼠和对照大鼠来源的pri-miR-29b2,经Northern杂交证实此多态性并不影响miR-29b2的加工成熟和表达。经生物信息学预测后克隆鉴定了pri-miR-29b2的启动子区域,预测的启动子序列在大鼠和小鼠内是完全一致的,且上游400bp处发现一个Myod的结合位点也是完全保守的。虽然此启动子和Myod的结合位点在人类是不保守的,但是Northern杂交实验同样证明Myod可激活miR-29b和miR-29c的表达,后经生物信息学预测发现,人的启动子区域上游也存在2个相邻的Myod的结合位点。因为胰岛素能在骨骼肌细胞(C2C12和L6)中诱导Myod的表达,据此我们提出一个模型为:高胰岛素刺激Myod的表达,后者则诱导miR-29b和miR-29c的表达。然而无论是高胰岛素和高葡萄糖导致的miR-29b的表达上调,还是Myod诱导的miR-29b和miR-29c的表达增加均不能解释2型糖尿病个体内miR-29家族三个成员的表达同时上调这一结果。综合前面的结果,我们提出过表达miR-29能在细胞水平上产生胰岛素抵抗效应,与高胰岛素高葡萄糖建立的胰岛素抵抗细胞模型具有较高的相似性,是阐明2型糖尿病胰岛素抵抗分子机制的一个重要补充。