目的:腰椎间盘突出症是一种引起下腰痛和坐骨神经痛的常见骨科疾病。国内外从细胞因子上及遗传学上对椎间盘突出症的机制的研究非常多，目前主要认为腰椎间盘突出症是由于椎间盘物理因素改变引起一系列生物学反应，从而引起髓核细胞凋亡，继而导致多因子功能改变而引起一系列表现。国内外学者研究腰椎间盘突出症多数从一两个基因或者细胞因子着手，而腰椎间盘突出症即是多因素协同作用的结果，因此，至今腰椎间盘突出症的详细机制目前尚不十分明了。蛋白质组学的产生，使人们能直接从蛋白质表达水平上揭示细胞、组织的表达丰度及其功能，克服了以往在DNA或RNA水平研究基因表达的缺陷——基因表达与DNA或RNA改变的不对应性，进而能够在细胞和生命有机体的整体水平阐明生命的本质和疾病形成的机制。 在本研究应用蛋白质组技术寻找椎间盘突出症患者和正常人的血清差异蛋白，并应用酶联免疫吸附试验对差异表达进行进一步验证。笔者希望所证实的差异蛋白能作为腰椎间盘突出症的生物标志物以及成为该疾病靶向治疗的位点。 材料与方法: 1、晨起空腹条件下采集腰椎间盘突出症患者和健康志愿者静脉血2ml，离心后收集血清，在每个样本上加入蛋白酶抑制剂，然后分离血清样本保存在—80℃备用。30微升血清样本放入1mL的离心管里面，根据ProteoPrepBlueAlbumin&IgGDepletionKit(SIGMA)试剂盒和2-Dcleanupkit(AmershamBiosciences)试剂盒的说明分别用于清除样本中的白蛋白与球蛋白和盐与脂。然后利用牛血清作为标准运用Bradford法测定浓度，下一步进行双向电泳。 2、双向电泳主要按照G(o)rg等方法和Bio—Rad仪器操作手册进行。第一相等电聚焦(IEF)，血清的上样量总体积为0.35ml，(含总蛋白质0.3mg)。等电聚焦结束后，迅速取出IPG胶条，分别置于平衡液中各平衡15分钟。预灌制好聚丙烯酰胺凝胶后，将平衡好的IPG胶条置于SDS胶面上，低熔点0.5％琼脂糖封胶，设定电泳条件进行垂直聚焦，直至溴酚蓝达胶底线停止电泳。随后对凝胶进行硝酸银银染。 3、凝胶图像分析凝胶通过ImageScannerⅡ透射扫描仪及Labscan扫描软件进行扫描获取图像，利用ImageMaster2DElite5.0分析软件对图像进行强度效正、点检测、背景消减、匹配。所有数据的统计分析在SPSS15.0软件上进行。 4、MALDI—TOF—TOF—MS质谱分析切取6个差异较明显表达的蛋白质点，通过胶内酶切，点样，应用基质辅助电离解析飞行时间质谱MALDI—TOF/TOF—MS鉴定蛋白质，获得蛋白质的肽质量指纹图谱(Peptidemassfingerprint，PMF)和二级质谱图。 5、数据库检索利用软件Mascotdistiller过滤基线峰、识别信号峰。利用Matrixscience公司的Mascot软件搜索NCBInr数据库(http：//www.matrixscience.com)，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。 6、酶联免疫吸附试验另外30例腰椎间盘突出患者和30例正常人及非椎间盘突出患者共30例利用酶联免疫吸附试验测定所得出蛋白的血清学水平。 结果： 1.建立了重复性好、分辨率高的LDH血清及正常人血清的双向凝胶电泳图谱，LDH组和正常对照组各3块凝胶间的平均蛋白质点数为(950±50)和(920±50)，其平均匹配百分率分别为85.8％和84.5％；同一样本3块不同胶之间在等电聚焦(Isoelectricfocusing，IEF)方向的平均偏差为1.08±0.15mm，在十二烷基磺酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecylsulfate—polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)方向上的平均偏差为1.19±0.28mm。 2.比较分析10例LDH血清及正常人血清的双向凝胶电泳图谱进行分析匹配，其平均匹配的点数为960个。筛选出在LDH血清和正常人血清差异表达的蛋白质共6个(表达量相差3倍以上的蛋白质点作为两组差异表达蛋白质)，其中3个蛋白点在LDH组中表达下调，2个蛋白点表达上调，1个点在正常组组中不表达。 3.对6个差异表达的蛋白质点进行MALDI—TOF/TOF—MS的鉴定，共获得4张蛋白质点的肽质量指纹图谱(PMF)，其中鉴定出一些与LDH发病机制可能相关的蛋白质，分别为载脂蛋白L1(apolipoprotein—L1，ApoL1)、四连接素(Tetranectin，TN)、载脂蛋白M(apolipoproteinM，ApoM)和免疫球蛋白轻链(immunoglobulinlightchain，IGL)。 4.酶联免疫吸附试验对ApoL1、TN、ApoM和IGL的表达情况进行验证。结果显示与双向电泳的分析结果是一致的，确实为阳性结果。 结论： 本研究采用比较蛋白质组学的方法对LDH血清和正常人血清进行研究，建立了重复性好、分辨率高的LDH血清和正常人血清的双向凝胶电泳图谱，比较分析两者蛋白质表达谱的差异，识别并鉴定出其中的差异蛋白质。结果找出并鉴定出6种差异表达的蛋白质。为了验证蛋白质鉴定结果的可靠性，采用酶联免疫吸附试验证实6种蛋白中的4种在血清里的表达，并与正常人存在差异。实验结果提示载脂蛋白L1、载脂蛋白M、四连接素、免疫球蛋白轻链的血清学水平可能作为腰椎间盘突出症的生物标志物，并可能进一步揭示腰椎间盘突出症的发病机制。