香气糖苷(糖苷态香气)是香气物质与糖类结合并以糖苷形式存在的一类非挥发性香气前体,其广泛存在于天然植物中。相比游离态香气物质,香气糖苷性质更稳定,且具有重要的生物学功能和巨大的商业价值。香气糖苷一般是由UDP-糖基转移酶(UGTs)以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为糖供体催化合成。课题组前期发现一种新型的茶树糖基转移酶CsUGT85A53,可在体外利用苯甲醇、苯乙醇等醇系香气合成相应糖苷。苯乙醇是茶树中花果的物质基础,研究苯乙醇可以改善茶叶的香气。但由于UDPG价格高昂,限制了其工业生产中的应用。少量研究表明蔗糖合酶(SUS)在一定条件下,可将UGTs参与的糖基化反应的副产物UDP转化成活化的UDPG,实现UDPG的原位再生。这既降低了反应所需UDPG成本,又避免了附产物UDP对目的产物合成的抑制作用。本研究首先尝试利用易错PCR技术对CsUGT85A53进行随机突变,研究突变对CsUGT85A53酶活性的影响;同时克隆茶树SUS基因,得到纯酶并进行酶活分析,构建含有SUS基因的工程菌,尝试建立UDPG原位再生体系,实现香气糖苷的高效生产。主要研究结果如下:1)通过易错PCR技术,构建了CsUGT85A53基因的随机突变体库。通过转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得了一些CsUGT85A53的突变基因,氨基酸突变率均在1%-2%之间。通过对这些突变体的重组蛋白进行酶活比较,获得了一个对正辛醇利用率显著提高的突变体。2)克隆并获得了 2条茶树蔗糖合酶(SUS)基因,实时定量PCR分析表明这两条SUS基因(命名为CsSUS2和CsSUS6)可对茶树低温胁迫产生明显响应,其中CsSUS2基因的表达量在低温处理后显著升高,而CsSUS6基因表达量则明显降低,推测其在茶树胁迫过程中发挥不同的生理功能。3)将这两条SUS基因连入pET-32a(+)载体中进行原核表达,CsSUS2和CsSUS6大小分别为91 KDa和89 KDa。将SUS与CsUGT85A53蛋白共同反应,在添加蔗糖而未添加UDPG的情况下,可成功检测到苯乙醇糖苷的合成,可见CsSUS2和CsSUS6均可实现UDPG的原位再生。与单独使用CsUGT85A53相比,相同的反应体系中加入CsSUS2和CsSUS6可显著提高苯乙醇糖苷的生成量且分别提高了 1.67倍与1.3倍;进一步分析表明,CsSUS2和CsSUS6还可改变山奈酚生成糖苷的加糖方式,CsSUS2可促进山奈酚二糖苷的合成,而CsSUS6可明显提高山奈酚3-OH位点的糖苷化。本课题实现了 UDPG的原位再生,可显著提高已知功能糖基转移酶合成苯乙醇糖苷的能力,还可改变山奈酚生成糖苷的加糖方式,促进山奈酚二糖苷的合成。