论文部分内容阅读
研究背景与目的：
肺癌起源于支气管黏膜上皮，其发病率和死亡率增长速度极快，严重威胁着人类的生命，仍是目前全世界最主要的癌症死亡原因之一。肺癌的发病原因至今尚未完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生关系密切，已有的研究表明:长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高，这可能是导致肺癌发病率和死亡率占男性所有恶性肿瘤之首的原因。然而，大量流行病学调查发现，肺癌发病率和死亡率在非吸烟的女性中亦均占第二位，仅位于乳腺癌之后。因此，除吸烟外，环境和职业接触史、电离辐射、既往肺部疾病、大气污染、家族聚集、遗传易感性以及免疫功能等因素均在肺癌的发生发展中占有举足轻重的地位。
肺癌发病隐匿，早期无特异性症状及体征，极易被患者忽视，临床上发现时多已是晚期，早已失去手术机会，预后极差。目前，肺癌的治疗除手术、放疗、化疗三大传统治疗外，还有免疫治疗、靶向治疗、基因治疗等，但并非所有肺癌均适用，肺癌的治疗与其组织学类型密切相关。组织学上，肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中，约85％的肺癌患者属于非小细胞肺癌，而非小细胞肺癌又包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等类型，小细胞肺癌对化疗、放疗较敏感，而非小细胞肺癌敏感性差。既往研究发现，肺鳞癌是非小细胞肺癌中的主要组织学类型，然而，近年来，越来越多的流行病学研究发现，肺腺癌正在逐渐取代肺鳞癌成为非小细胞肺癌中的主要组织学类型。近年来，通过世界各国广大研究者和临床医师的努力，肺癌在早期预防、手术方式、放疗模式和药物治疗方面均取得了显著进步，但肺癌的发病率和死亡率仍高居恶性肿瘤之首，总体预后并无明显改善，5年生存率仍低，急需寻找新的肺癌治疗模式。随着世界各国科学家对蛋白组学、基因组学、分子生物学等研究的不断深入，肿瘤标志物的研究使肺癌的早期诊断及预防取得了突飞猛进的成效，基于基因水平的小分子抑制剂和靶向治疗为各种肿瘤的治疗提供了新的方向。因此，深入探索与非小细胞肺癌(尤其是肺腺癌)发生发展相关的基因及其调控的信号通路，将有助于我们进一步研究肺癌的发病机理，为寻找与肺癌发病及预后相关的分子标记物或寻找新的肺癌治疗方法提供理论依据。
肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor， HDGF)是1989年由NakamuraH等人从人肝癌细胞株Huh-7的培养基中分离提取出的肝素结合蛋白。基因水平研究发现，HDGF基因定位于lq21-q23，包括24828个碱基，包含5个内含子和6个外显子，其编码蛋白包含240个氨基酸残基，分子量约为26kDa。研究发现，HDGF具有有丝分裂原的作用，在胚胎肾、肝、肺、血管等组织中高表达，与这些组织的生长发育密切相关，胎儿出生后其表达明显降低。近年来越来越多研究发现，HDGF在多种恶性肿瘤细胞中均具有有丝分裂原作用，可促进肿瘤细胞生长、促进血管生成和抑制肿瘤分化，由此可见，HDGF与肿瘤的发生、发展密切相关。
许多临床研究证实:HDGF在多种恶性肿瘤组织中高表达，与肿瘤进展及预后密切相关，可作为一个独立的预后因素。例如，Hu等研究发现，与周围正常肝组织相比，HDGF在肝癌组织中高表达，与AFP表达水平、肿瘤分期、肿瘤分化程度等相关，是影响患者预后的独立危险因素。在胃癌中，Yamamoto等发现高表达的HDGF与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移和血管淋巴管侵袭相关，是影响胃癌患者总生存期和无病生存期的独立预后因素。除此之外，HDGF亦被发现在胰腺癌、胃肠间质瘤、食管癌、胆囊癌、胶质瘤、子宫内膜癌等多种肿瘤中高表达，与这些肿瘤患者的预后密切相关。然而，HDGF在肺癌中的表达及其与其他因子间的关系尚未完全阐明。
蛋白激酶C(PKC)是一类能使底物蛋白分子内丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶。PKC最早是由Nishizuka等于1977年从鼠脑中发现的，随后，研究者发现这类激酶可以被甘油二酯、磷脂酞丝氨酸(PS)和佛波酯(PMA)等激活。迄今为止，研究发现哺乳动物细胞内的PKC家族蛋白主要是由9个基因编码的10个同工酶组成。根据各亚型的结构及底物的不同，将PKC分为3组:①经典型PKC(classical or conventional PKC，cPKC)包括a、βⅠ、βⅡ等4种亚型，该组PKC具有典型结构，可被甘油二酯(DAG)、Ca2+和磷脂酰丝氨酸(PS)或佛波酯(phorbolester，PMA)等激活;②新奇型PKCs(novel PKC，nPKC)，该组包括δ、ε、η和θ等4种亚型，其激活只需要DAG或PMA;③非经典型PKC(atypical PKC，aPKC)包括ι/λ和ζ等两种，目前其确切的激活机制尚不清楚。
大量研究发现，PKC在机体多种组织的形成和过程中发挥重要作用，可促进机体细胞的分化、增殖、凋亡和基因的表达等。蛋白激酶Ca(PRKCA)是蛋白激酶C家族重要成员之一，研究显示，PRKCA在多种肿瘤的发生和进展过程中具有重要作用，且其在不同类型肿瘤中表达存在差异。已有研究表明，PRKCA在胶质瘤、肺癌、肝癌等肿瘤中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤进展。本课题组前期研究发现，HDGF可通过调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖，然而，HDGF和PRKCA在肺癌中的表达及其HDGF调控PRKCA的机制至今尚未完全阐明。
基于以上研究背景及现状，本课题的研究目的是明确HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中的表达情况，及其与肺腺癌患者临床病理参数之间的关系，分析HDGF与PRKCA之间的相关性，探讨其与患者预后的关系，并进一步深入分析HDGF调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖的具体机制，最终明确HDGF可通过调控miR-374b靶向作用PRKCA促进肺腺癌细胞增殖，为肺癌的预防和预后及治疗提供实验室依据。
本课题的研究主要从以下三部分进行展开，(1)第一部分:检索GEO数据库，提取数据库数据从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌中的表达情况;同时收集123例肺腺癌及64例正常肺组织石蜡标本，制备石蜡切片，利用免疫组化方法分别检测HDGF和PRKCA蛋白在123例肺腺癌及64例正常肺组织石蜡组织标本中的表达及定位情况。结合病人临床病理参数资料，分别统计分析HDGF和PRKCA表达水平和临床病理参数及肺腺癌患者预后之间的关系。进一步分别从基因水平和蛋白水平分析HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中的相关性。(2)第二部分:在稳定敲减HDGF的细胞中，利用miRNA芯片分析寻找受HDGF调控的miRNAs;同时利用生物信息学方法预测可能调控PRKCA的miRNAs，联合分析两组miRNAs数据，寻找受HDGF调控后可调节PRKCA表达的miRNA(miR-374b);进一步利用Westernblot检测抑制miR-374b后HDGF调控的PRKCA及细胞增殖相关蛋白的变化。(3)第三部分:利用miR-374bmimics过表达肺腺癌细胞中miR-374b，利用MTT等方法检测miR-374b对肺腺癌细胞增殖的影响，并利用Westernblot检测过表达miR-374b对PRKCA及细胞增殖相关蛋白的影响。miR-374b对PRKCA调控机制方面，利用生物信息学方法预测miR-374b与PRKCA3-UTR结合位点，构建PRKCA3-UTR野生型及突变型质粒，利用双荧光素酶报告系统分析miR-374b与PRKCA3-UTR的结合作用。
第一部分HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中的表达及其相关性研究
研究内容与方法：
(1)检索GEO数据库，提取数据库数据，从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌中的表达情况。
(2)收集123例肺腺癌组织标本，同时收集正常肺组织石蜡标本(包括自癌灶边缘5cm以外取材，经2个病理医师证实切片无癌细胞浸润)作为正常对照，共计64例。连续切片，厚度为4μm。
(3)采用免疫组织化学方法，分别检测HDGF蛋白和PRKCA蛋白在123例肺腺癌组织切片及64例正常肺组织切片中的表达情况，分别分析其表达及不同亚细胞定位情况，并进一步分别分析HDGF和PRKCA蛋白表达水平与患者临床病理参数和患者预后之间的关系。
(4)从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在正常肺组织、非小细胞肺癌组织、正常肺组织+非小细胞肺癌组织、肺大细胞组织、肺腺癌、肺鳞癌组织中的相关性。
(5)从蛋白水平分析123例肺腺癌组织中HDGF和PRKCA蛋白的相关性。
(6)联合分析HDGF蛋白和PRKCA蛋白对肺腺癌患者预后的影响。
结果：
提取GEO数据库数据，从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌中的表达情况发现，HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌组织中均高表达;进一步亚组分析亦发现，HDGF和PRKCA在肺鳞癌、肺腺癌、大细胞癌中表达均较正常肺组织高。蛋白水平分析发现，HDGF在肺腺癌组织和正常肺组织中均主要定位于细胞核，而PRKCA在肺腺癌组织和正常肺组织中均主要定位于细胞胞浆;与正常肺组织组比较，肿瘤组HDGF阳性率和PRKCA阳性率均明显高于正常肺对照组，差异均具有明显统计学意义(HDGF组P=0.002，PRKCA组P=0.007)。临床病理参数分析发现:HDGF高表达与肺腺癌N分期、淋巴结转移、临床分期显著相关(P＜0.05)，而HDGF高表达与肿瘤患者性别、年龄、T分期无明显关系(P＞0.05);PRKCA高表达与肺腺癌T分期、N分期、淋巴结转移、临床分期显著相关(P＜0.05)，而PRKCA高表达与肿瘤患者性别、年龄无明显关系(P＞0.05)。进一步采用Kmplot数据库和收集123例肺腺癌组织的预后信息分析均发现，HDGF或PRKCA表达越高，患者的生存时间明显缩短(P＜0.05)。多因素Cox回归分析表明HDGF和PRKCA均不可作为影响肺腺癌患者预后的独立危险因素(P＞0.05)。
HDGF和PRKCA相关性分析方面，基因水平分析发现，HDGF和PRKCA在正常肺组织、正常肺组织+非小细胞肺癌组织、肺鳞癌中正相关(P＜0.05);而在非小细胞肺癌组织、大细胞肺癌组织、肺腺癌组织中无明显相关性(P＞0.05)。蛋白水平分析发现，在123例肺腺癌组织中，HDGF蛋白和PRKCA蛋白呈正相关关系(r=0.208，P=0.021)。进一步Kaplan-Meier生存分析联合分析HDGF蛋白和PRKCA蛋白联合表达对肺腺癌患者总生存期的影响，结果显示:与HDGF和PRKCA蛋白均低表达患者比较，HDGF或PRKCA蛋白高表达者总生存期缩短，且HDGF和PRKCA两者同时高表达者生存期最短，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。运用Cox单因素分析显示，T分期、N分期、淋巴结转移、AJCC临床分期、HDGF表达情况和PRKCA表达情况均是肺腺癌患者总生存期的影响因素，随着T分期、N分期、淋巴结转移、AJCC临床分期的进展、HDGF表达和PRKCA表达的增加，患者的总生存期缩短，死亡风险增加。Cox多因素分析显示:T分期、N分期、淋巴结转移、AJCC临床分期、HDGF表达情况和PRKCA表达情况均不能独立影响肺腺癌患者的总生存期。
结论：
1.HDGF和PRKCA均在肺腺癌组织中高表达，可能与肺腺癌的发生发展密切相关。
2.HDGF或PRKCA高表达与肺腺癌患者的不良预后密切相关，但均不是影响肺腺癌患者预后的独立预后因素。
3.HDGF和PRKCA高表达可能作为预测肺腺癌患者不良预后的分子标记物，临床上联合检测HDGF和PRKCA蛋白表达，可预测肺腺癌患者预后。
4.基因水平上，HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中无明显相关性。
5.蛋白水平上，HDGF蛋白和PRKCA蛋白在肺腺癌组织中呈正相关关系。
6.肺腺癌中，HDGF可能通过转录后水平调控PRKCA的表达。
第二部分HDGF通过miR-374b调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖
研究内容与方法
(1)本课题组前期在肺腺癌中的研究发现，PRKCA为HDGF调控通路的下游分子，HDGF可通过调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖。为了进一步探讨HDGF调控PRKCA的机制，本研究首先将携带有能特异性敲减HDGF基因的shRNA质粒包装合成慢病毒，随后用慢病毒感染细胞构建能够稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞株，并使用Westernblot测定细胞中HDGF和PRKCA水平。
(2)在稳定敲减HDGF的细胞中，利用miRNA芯片分析寻找受HDGF调控的miRNAs;同时利用生物信息学方法预测可能调控PRKCA的miRNAs，联合分析两组miRNAs数据，寻找受HDGF调控后可调节PRKCA表达的miRNA(miR-374b)。
(3)在稳定敲减HDGF的细胞中瞬时转染miR-374binhibitor，采用MTT和Edu实验检测细胞增殖及处于细胞周期S期细胞比例的变化。
(4)在稳定敲减HDGF的细胞中瞬时转染miR-374binhibitor，利用Westernblot检测抑制miR-374b后HDGF调控的PRKCA及细胞增殖相关蛋白的变化。
结果：
利用携带有能特异性敲减HDGF基因的shRNA慢病毒构建稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞株后，采用Westernblot检测PRKCA的表达发现敲减HDGF后肺腺癌细胞中PRKCA表达降低，即HDGF可调控PRKCA表达。为进一步寻找HDGF调控PRKCA的机制，本研究利用miRNA表达谱芯片检测敲减和未敲减HDGF细胞中miRNA的变化，共发现可能受HDGF调控的33个差异miRNA;随后我们采用TargetScan和microRNA.org网站预测可能靶向调节PRKCA的miRNAs;最后将三组miRNA取交集获得miR-374b为受HDGF调控后可靶向调控PRKCA的候选miRNA。进一步采用Q-PCR验证发现，敲减HDGF可使miR-374b的表达升高;在稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞中用miR-374binhibitor抑制miR-374b的表达后，稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞增殖能力增快，处于细胞周期S期细胞比例增加。机制方面，抑制miR-374b后，稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞中PRKCA、k-Ras、c-Myc、CCND1的表达较前升高，说明抑制miR-374b可逆转稳定敲减HDGF细胞内PRKCA下游相关通路的表达，从而促进细胞增殖。
结论：
1.HDGF可调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖。
2.在肺腺癌细胞中，敲减HDGF可促进miR-374b的表达。
3.抑制miR-374b可逆转稳定敲减HDGF细胞内PRKCA下游相关通路的表达，从而促进细胞增殖，即HDGF可通过miR-374b调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖。
4.PRKCA可能是miR-374b的候选靶基因。
第三部分miR-374b靶向调控PRKCA抑制肺腺癌细胞增殖
研究内容与方法：
(1)利用miR-374bmimics分别瞬时转染肺腺癌细胞A549和SPCA-1，并通过Q-PCR检测miR-374b的表达。
(2)分别采用MTT和Edu实验检测miR-374b对肺腺癌细胞增殖及处于细胞周期S期细胞比例的影响。
(3)采用Westernblot检测miR-374b对PRKCA及其下游细胞增殖相关蛋白的影响。
(4)生物信息学分析miR-374b与其靶基因PRKCA的结合位点后，采用双荧光素酶实验验证miR-374b与PRKCA3-UTR直接结合作用。
(5)利用Q-PCR实验检测miR-374b对肺腺癌细胞中PRKCAmRNA水平的影响。
结果：
细胞功能学上，利用miR-374bmimics过表达miR-374b后，MTT实验发现肺腺癌细胞增殖能力受抑制，Edu实验检测发现处于细胞周期S期细胞比例较前减少。机制上，利用Westernblot检测发现过表达miR-374b后，肺腺癌细胞中PRKCA、k-Ras、c-Myc、CCND1的表达较前下降。利用生物信息学分析miR-374b与其靶基因PRKCA3UTR的结合位点后，采用双荧光素酶实验发现PRKCAwt3UTR和miR-374bmimics共转染可明显降低荧光素酶的活性，PRKCAwt3UTR与miR-374binhibitor共转染时可增强荧光素酶活性;PRKCAmut3UTR和psiCHECK-2分别与miR-374bmimics和inhibitor共转染后，荧光素酶活性均没有明显变化，说明miR-374b能够与PRKCA3UTR直接结合。进一步采用Q-PCR检测PRKCAmRNA的变化发现，过表达miR-374b后，肺腺癌细胞中PRKCAmRNA表达无明显变化，说明miR-374b调控PRKCA基因的转录后水平。
结论：
1.miR-374b可抑制肺腺癌细胞增殖及细胞周期的G1/S转化。
2.miR-374b可抑制PRKCA及其下游细胞增殖相关蛋白。
3.miR-374b可与PRKCA3UTR直接结合从而靶向调控PRKCA蛋白表达。
4.miR-374b对PRKCA的调控作用是通过影响其转录后水平实现的。
肺癌起源于支气管黏膜上皮，其发病率和死亡率增长速度极快，严重威胁着人类的生命，仍是目前全世界最主要的癌症死亡原因之一。肺癌的发病原因至今尚未完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生关系密切，已有的研究表明:长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高，这可能是导致肺癌发病率和死亡率占男性所有恶性肿瘤之首的原因。然而，大量流行病学调查发现，肺癌发病率和死亡率在非吸烟的女性中亦均占第二位，仅位于乳腺癌之后。因此，除吸烟外，环境和职业接触史、电离辐射、既往肺部疾病、大气污染、家族聚集、遗传易感性以及免疫功能等因素均在肺癌的发生发展中占有举足轻重的地位。
肺癌发病隐匿，早期无特异性症状及体征，极易被患者忽视，临床上发现时多已是晚期，早已失去手术机会，预后极差。目前，肺癌的治疗除手术、放疗、化疗三大传统治疗外，还有免疫治疗、靶向治疗、基因治疗等，但并非所有肺癌均适用，肺癌的治疗与其组织学类型密切相关。组织学上，肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中，约85％的肺癌患者属于非小细胞肺癌，而非小细胞肺癌又包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等类型，小细胞肺癌对化疗、放疗较敏感，而非小细胞肺癌敏感性差。既往研究发现，肺鳞癌是非小细胞肺癌中的主要组织学类型，然而，近年来，越来越多的流行病学研究发现，肺腺癌正在逐渐取代肺鳞癌成为非小细胞肺癌中的主要组织学类型。近年来，通过世界各国广大研究者和临床医师的努力，肺癌在早期预防、手术方式、放疗模式和药物治疗方面均取得了显著进步，但肺癌的发病率和死亡率仍高居恶性肿瘤之首，总体预后并无明显改善，5年生存率仍低，急需寻找新的肺癌治疗模式。随着世界各国科学家对蛋白组学、基因组学、分子生物学等研究的不断深入，肿瘤标志物的研究使肺癌的早期诊断及预防取得了突飞猛进的成效，基于基因水平的小分子抑制剂和靶向治疗为各种肿瘤的治疗提供了新的方向。因此，深入探索与非小细胞肺癌(尤其是肺腺癌)发生发展相关的基因及其调控的信号通路，将有助于我们进一步研究肺癌的发病机理，为寻找与肺癌发病及预后相关的分子标记物或寻找新的肺癌治疗方法提供理论依据。
肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor， HDGF)是1989年由NakamuraH等人从人肝癌细胞株Huh-7的培养基中分离提取出的肝素结合蛋白。基因水平研究发现，HDGF基因定位于lq21-q23，包括24828个碱基，包含5个内含子和6个外显子，其编码蛋白包含240个氨基酸残基，分子量约为26kDa。研究发现，HDGF具有有丝分裂原的作用，在胚胎肾、肝、肺、血管等组织中高表达，与这些组织的生长发育密切相关，胎儿出生后其表达明显降低。近年来越来越多研究发现，HDGF在多种恶性肿瘤细胞中均具有有丝分裂原作用，可促进肿瘤细胞生长、促进血管生成和抑制肿瘤分化，由此可见，HDGF与肿瘤的发生、发展密切相关。
许多临床研究证实:HDGF在多种恶性肿瘤组织中高表达，与肿瘤进展及预后密切相关，可作为一个独立的预后因素。例如，Hu等研究发现，与周围正常肝组织相比，HDGF在肝癌组织中高表达，与AFP表达水平、肿瘤分期、肿瘤分化程度等相关，是影响患者预后的独立危险因素。在胃癌中，Yamamoto等发现高表达的HDGF与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移和血管淋巴管侵袭相关，是影响胃癌患者总生存期和无病生存期的独立预后因素。除此之外，HDGF亦被发现在胰腺癌、胃肠间质瘤、食管癌、胆囊癌、胶质瘤、子宫内膜癌等多种肿瘤中高表达，与这些肿瘤患者的预后密切相关。然而，HDGF在肺癌中的表达及其与其他因子间的关系尚未完全阐明。
蛋白激酶C(PKC)是一类能使底物蛋白分子内丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶。PKC最早是由Nishizuka等于1977年从鼠脑中发现的，随后，研究者发现这类激酶可以被甘油二酯、磷脂酞丝氨酸(PS)和佛波酯(PMA)等激活。迄今为止，研究发现哺乳动物细胞内的PKC家族蛋白主要是由9个基因编码的10个同工酶组成。根据各亚型的结构及底物的不同，将PKC分为3组:①经典型PKC(classical or conventional PKC，cPKC)包括a、βⅠ、βⅡ等4种亚型，该组PKC具有典型结构，可被甘油二酯(DAG)、Ca2+和磷脂酰丝氨酸(PS)或佛波酯(phorbolester，PMA)等激活;②新奇型PKCs(novel PKC，nPKC)，该组包括δ、ε、η和θ等4种亚型，其激活只需要DAG或PMA;③非经典型PKC(atypical PKC，aPKC)包括ι/λ和ζ等两种，目前其确切的激活机制尚不清楚。
大量研究发现，PKC在机体多种组织的形成和过程中发挥重要作用，可促进机体细胞的分化、增殖、凋亡和基因的表达等。蛋白激酶Ca(PRKCA)是蛋白激酶C家族重要成员之一，研究显示，PRKCA在多种肿瘤的发生和进展过程中具有重要作用，且其在不同类型肿瘤中表达存在差异。已有研究表明，PRKCA在胶质瘤、肺癌、肝癌等肿瘤中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤进展。本课题组前期研究发现，HDGF可通过调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖，然而，HDGF和PRKCA在肺癌中的表达及其HDGF调控PRKCA的机制至今尚未完全阐明。
基于以上研究背景及现状，本课题的研究目的是明确HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中的表达情况，及其与肺腺癌患者临床病理参数之间的关系，分析HDGF与PRKCA之间的相关性，探讨其与患者预后的关系，并进一步深入分析HDGF调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖的具体机制，最终明确HDGF可通过调控miR-374b靶向作用PRKCA促进肺腺癌细胞增殖，为肺癌的预防和预后及治疗提供实验室依据。
本课题的研究主要从以下三部分进行展开，(1)第一部分:检索GEO数据库，提取数据库数据从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌中的表达情况;同时收集123例肺腺癌及64例正常肺组织石蜡标本，制备石蜡切片，利用免疫组化方法分别检测HDGF和PRKCA蛋白在123例肺腺癌及64例正常肺组织石蜡组织标本中的表达及定位情况。结合病人临床病理参数资料，分别统计分析HDGF和PRKCA表达水平和临床病理参数及肺腺癌患者预后之间的关系。进一步分别从基因水平和蛋白水平分析HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中的相关性。(2)第二部分:在稳定敲减HDGF的细胞中，利用miRNA芯片分析寻找受HDGF调控的miRNAs;同时利用生物信息学方法预测可能调控PRKCA的miRNAs，联合分析两组miRNAs数据，寻找受HDGF调控后可调节PRKCA表达的miRNA(miR-374b);进一步利用Westernblot检测抑制miR-374b后HDGF调控的PRKCA及细胞增殖相关蛋白的变化。(3)第三部分:利用miR-374bmimics过表达肺腺癌细胞中miR-374b，利用MTT等方法检测miR-374b对肺腺癌细胞增殖的影响，并利用Westernblot检测过表达miR-374b对PRKCA及细胞增殖相关蛋白的影响。miR-374b对PRKCA调控机制方面，利用生物信息学方法预测miR-374b与PRKCA3-UTR结合位点，构建PRKCA3-UTR野生型及突变型质粒，利用双荧光素酶报告系统分析miR-374b与PRKCA3-UTR的结合作用。
第一部分HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中的表达及其相关性研究
研究内容与方法：
(1)检索GEO数据库，提取数据库数据，从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌中的表达情况。
(2)收集123例肺腺癌组织标本，同时收集正常肺组织石蜡标本(包括自癌灶边缘5cm以外取材，经2个病理医师证实切片无癌细胞浸润)作为正常对照，共计64例。连续切片，厚度为4μm。
(3)采用免疫组织化学方法，分别检测HDGF蛋白和PRKCA蛋白在123例肺腺癌组织切片及64例正常肺组织切片中的表达情况，分别分析其表达及不同亚细胞定位情况，并进一步分别分析HDGF和PRKCA蛋白表达水平与患者临床病理参数和患者预后之间的关系。
(4)从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在正常肺组织、非小细胞肺癌组织、正常肺组织+非小细胞肺癌组织、肺大细胞组织、肺腺癌、肺鳞癌组织中的相关性。
(5)从蛋白水平分析123例肺腺癌组织中HDGF和PRKCA蛋白的相关性。
(6)联合分析HDGF蛋白和PRKCA蛋白对肺腺癌患者预后的影响。
结果：
提取GEO数据库数据，从基因水平分别分析HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌中的表达情况发现，HDGF和PRKCA在非小细胞肺癌组织中均高表达;进一步亚组分析亦发现，HDGF和PRKCA在肺鳞癌、肺腺癌、大细胞癌中表达均较正常肺组织高。蛋白水平分析发现，HDGF在肺腺癌组织和正常肺组织中均主要定位于细胞核，而PRKCA在肺腺癌组织和正常肺组织中均主要定位于细胞胞浆;与正常肺组织组比较，肿瘤组HDGF阳性率和PRKCA阳性率均明显高于正常肺对照组，差异均具有明显统计学意义(HDGF组P=0.002，PRKCA组P=0.007)。临床病理参数分析发现:HDGF高表达与肺腺癌N分期、淋巴结转移、临床分期显著相关(P＜0.05)，而HDGF高表达与肿瘤患者性别、年龄、T分期无明显关系(P＞0.05);PRKCA高表达与肺腺癌T分期、N分期、淋巴结转移、临床分期显著相关(P＜0.05)，而PRKCA高表达与肿瘤患者性别、年龄无明显关系(P＞0.05)。进一步采用Kmplot数据库和收集123例肺腺癌组织的预后信息分析均发现，HDGF或PRKCA表达越高，患者的生存时间明显缩短(P＜0.05)。多因素Cox回归分析表明HDGF和PRKCA均不可作为影响肺腺癌患者预后的独立危险因素(P＞0.05)。
HDGF和PRKCA相关性分析方面，基因水平分析发现，HDGF和PRKCA在正常肺组织、正常肺组织+非小细胞肺癌组织、肺鳞癌中正相关(P＜0.05);而在非小细胞肺癌组织、大细胞肺癌组织、肺腺癌组织中无明显相关性(P＞0.05)。蛋白水平分析发现，在123例肺腺癌组织中，HDGF蛋白和PRKCA蛋白呈正相关关系(r=0.208，P=0.021)。进一步Kaplan-Meier生存分析联合分析HDGF蛋白和PRKCA蛋白联合表达对肺腺癌患者总生存期的影响，结果显示:与HDGF和PRKCA蛋白均低表达患者比较，HDGF或PRKCA蛋白高表达者总生存期缩短，且HDGF和PRKCA两者同时高表达者生存期最短，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。运用Cox单因素分析显示，T分期、N分期、淋巴结转移、AJCC临床分期、HDGF表达情况和PRKCA表达情况均是肺腺癌患者总生存期的影响因素，随着T分期、N分期、淋巴结转移、AJCC临床分期的进展、HDGF表达和PRKCA表达的增加，患者的总生存期缩短，死亡风险增加。Cox多因素分析显示:T分期、N分期、淋巴结转移、AJCC临床分期、HDGF表达情况和PRKCA表达情况均不能独立影响肺腺癌患者的总生存期。
结论：
1.HDGF和PRKCA均在肺腺癌组织中高表达，可能与肺腺癌的发生发展密切相关。
2.HDGF或PRKCA高表达与肺腺癌患者的不良预后密切相关，但均不是影响肺腺癌患者预后的独立预后因素。
3.HDGF和PRKCA高表达可能作为预测肺腺癌患者不良预后的分子标记物，临床上联合检测HDGF和PRKCA蛋白表达，可预测肺腺癌患者预后。
4.基因水平上，HDGF和PRKCA在肺腺癌组织中无明显相关性。
5.蛋白水平上，HDGF蛋白和PRKCA蛋白在肺腺癌组织中呈正相关关系。
6.肺腺癌中，HDGF可能通过转录后水平调控PRKCA的表达。
第二部分HDGF通过miR-374b调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖
研究内容与方法
(1)本课题组前期在肺腺癌中的研究发现，PRKCA为HDGF调控通路的下游分子，HDGF可通过调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖。为了进一步探讨HDGF调控PRKCA的机制，本研究首先将携带有能特异性敲减HDGF基因的shRNA质粒包装合成慢病毒，随后用慢病毒感染细胞构建能够稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞株，并使用Westernblot测定细胞中HDGF和PRKCA水平。
(2)在稳定敲减HDGF的细胞中，利用miRNA芯片分析寻找受HDGF调控的miRNAs;同时利用生物信息学方法预测可能调控PRKCA的miRNAs，联合分析两组miRNAs数据，寻找受HDGF调控后可调节PRKCA表达的miRNA(miR-374b)。
(3)在稳定敲减HDGF的细胞中瞬时转染miR-374binhibitor，采用MTT和Edu实验检测细胞增殖及处于细胞周期S期细胞比例的变化。
(4)在稳定敲减HDGF的细胞中瞬时转染miR-374binhibitor，利用Westernblot检测抑制miR-374b后HDGF调控的PRKCA及细胞增殖相关蛋白的变化。
结果：
利用携带有能特异性敲减HDGF基因的shRNA慢病毒构建稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞株后，采用Westernblot检测PRKCA的表达发现敲减HDGF后肺腺癌细胞中PRKCA表达降低，即HDGF可调控PRKCA表达。为进一步寻找HDGF调控PRKCA的机制，本研究利用miRNA表达谱芯片检测敲减和未敲减HDGF细胞中miRNA的变化，共发现可能受HDGF调控的33个差异miRNA;随后我们采用TargetScan和microRNA.org网站预测可能靶向调节PRKCA的miRNAs;最后将三组miRNA取交集获得miR-374b为受HDGF调控后可靶向调控PRKCA的候选miRNA。进一步采用Q-PCR验证发现，敲减HDGF可使miR-374b的表达升高;在稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞中用miR-374binhibitor抑制miR-374b的表达后，稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞增殖能力增快，处于细胞周期S期细胞比例增加。机制方面，抑制miR-374b后，稳定敲减HDGF的肺腺癌细胞中PRKCA、k-Ras、c-Myc、CCND1的表达较前升高，说明抑制miR-374b可逆转稳定敲减HDGF细胞内PRKCA下游相关通路的表达，从而促进细胞增殖。
结论：
1.HDGF可调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖。
2.在肺腺癌细胞中，敲减HDGF可促进miR-374b的表达。
3.抑制miR-374b可逆转稳定敲减HDGF细胞内PRKCA下游相关通路的表达，从而促进细胞增殖，即HDGF可通过miR-374b调控PRKCA促进肺腺癌细胞增殖。
4.PRKCA可能是miR-374b的候选靶基因。
第三部分miR-374b靶向调控PRKCA抑制肺腺癌细胞增殖
研究内容与方法：
(1)利用miR-374bmimics分别瞬时转染肺腺癌细胞A549和SPCA-1，并通过Q-PCR检测miR-374b的表达。
(2)分别采用MTT和Edu实验检测miR-374b对肺腺癌细胞增殖及处于细胞周期S期细胞比例的影响。
(3)采用Westernblot检测miR-374b对PRKCA及其下游细胞增殖相关蛋白的影响。
(4)生物信息学分析miR-374b与其靶基因PRKCA的结合位点后，采用双荧光素酶实验验证miR-374b与PRKCA3-UTR直接结合作用。
(5)利用Q-PCR实验检测miR-374b对肺腺癌细胞中PRKCAmRNA水平的影响。
结果：
细胞功能学上，利用miR-374bmimics过表达miR-374b后，MTT实验发现肺腺癌细胞增殖能力受抑制，Edu实验检测发现处于细胞周期S期细胞比例较前减少。机制上，利用Westernblot检测发现过表达miR-374b后，肺腺癌细胞中PRKCA、k-Ras、c-Myc、CCND1的表达较前下降。利用生物信息学分析miR-374b与其靶基因PRKCA3UTR的结合位点后，采用双荧光素酶实验发现PRKCAwt3UTR和miR-374bmimics共转染可明显降低荧光素酶的活性，PRKCAwt3UTR与miR-374binhibitor共转染时可增强荧光素酶活性;PRKCAmut3UTR和psiCHECK-2分别与miR-374bmimics和inhibitor共转染后，荧光素酶活性均没有明显变化，说明miR-374b能够与PRKCA3UTR直接结合。进一步采用Q-PCR检测PRKCAmRNA的变化发现，过表达miR-374b后，肺腺癌细胞中PRKCAmRNA表达无明显变化，说明miR-374b调控PRKCA基因的转录后水平。
结论：
1.miR-374b可抑制肺腺癌细胞增殖及细胞周期的G1/S转化。
2.miR-374b可抑制PRKCA及其下游细胞增殖相关蛋白。
3.miR-374b可与PRKCA3UTR直接结合从而靶向调控PRKCA蛋白表达。
4.miR-374b对PRKCA的调控作用是通过影响其转录后水平实现的。