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本课题组分离获得一株加利利链霉菌(Streptommyces galilaeus)AF1菌株,前期研究发现AF1菌株代谢物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus)和路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)等革兰氏阳性细菌有较好的抑制作用,对耐药菌MRSA(Methicillin-resistant S.aureus,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)同样有效。AF1菌株代谢物抗菌机理初步研究发现,能够杀灭静息革兰氏阳性菌细胞,但对革兰氏阴性菌没有作用,作用机理与现有抗生素有所不同。加利利链霉菌AF1代谢产物具有开发新型抗生素的潜力。本文以无乳链球菌和MRSA为指示菌,系统研究了加利链霉菌利AF1代谢粗提物对无乳链球菌和MRSA的抗菌活性及作用机理;采用活性跟踪法,对AF1菌株代谢产物进行分离纯化;优化了固体发酵生产AF1菌株孢子的条件,以期为加利利链霉菌AF1的进一步开发利用提供理论基础。利用平板打孔法测得AF1菌株代谢粗提物对测试的革兰氏阳性菌无乳链球菌(S.agalactiae)、白葡萄球菌(S.albus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)具有不同的抑菌效果,对革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、青枯病病菌(Ralstonia solanacearum)无抑制作用。抑菌活性测定结果表明AF1菌株代谢粗提物对无乳链球菌的MIC(最低抑菌浓度)为38μg/mL,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC为68μg/mL。与常见治疗无乳链球菌的药物氨苄青霉素、头孢菌素、氯霉素、利福平抑菌活性相比,AF1菌株代谢粗提物对无乳链球菌有很好的抑菌效果。采用细菌生长曲线法、直接计数法和形态观察法研究了AF1菌株代谢粗提物杀菌作用,结果表明粗提物对无乳链球菌和MRSA具有一定的杀菌作用,致死效果表现出良好的剂量-时间关系;扫描电镜结果显示粗提物作用后的菌体细胞形态发生了改变,菌体严重破坏;利用碱性磷酸酶含量测定细胞壁通透性结果表明处理后的菌体细胞壁通透性增加;流式细胞仪测定菌体细胞膜电位无明显变化。试验结果表明AF1菌株代谢粗提物对细菌细胞壁有破坏作用,对细胞膜没有直接作用。采用静态法和拌饲喂食法进行了安全性试验,结果表明AF1菌株代谢粗提物对斑马鱼的LC50分别为27.44mg/L、35.44 mg/L,表明AF1菌株代谢粗提物对斑马鱼低毒安全。以无乳链球菌为试验菌,采用活性跟踪法,通过硅胶柱层析、薄层层析、高效液相色谱等技术对AF1菌株发酵液乙酸乙酯粗提物进行分离,收集相应的组分,通过活性跟踪测定,分离到具有抗菌活性的馏分C3。进一步纯化并进行核磁共振(NMR)分析,依据现有的相关数据推测其可能为二氢菲类化合物,纯化得到的活性物质对无乳链球菌有很好的抑菌作用。为了获得数量多质量好的孢子,利用固体发酵对加利利链霉菌AF1产孢条件进行优化。首先采用单因素试验对培养加利利链霉菌AF1菌株的固体产孢基质(大米、玉米粉、木薯渣、黄豆粉、麸皮、麦片)进行初步筛选,研究了培养时间、温度、料液比、接种量、外加碳源、外加氮源等因素对加利利链霉菌AF1产孢量的影响。在单因素试验基础上,采用正交试验对AF1菌株产孢条件进行优化。筛选得到最佳固体产孢基质为大米。试验优化后的得到的培养条件为:培养温度28℃,培养时间6 d,接种量10%(每20 g大米接种2 mL孢子悬液),初始料(g)液(mL)比为1:1,葡萄糖添加量1.5%(质量分数),蛋白胨添加量1.5%(质量分数),在最佳的培养条件下,加利利链霉菌AF1菌株产孢数达到3.87×109 g-1,比优化前提高了29%。优化的培养条件下得到的加利利链霉菌AF1菌株产孢水平高,能适应大规模培养接种体的要求。