菌株LH-1发酵生产萜类活性物质的探索

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当前,多孔菌凭借自身广泛的应用性受到研究人员的高度重视。本文中所涉及的菌株LH-1是一株,在人工发酵条件下可以产生大量次生代谢产物的多孔菌。由实验室前期在野外工作中采集获得的,到目前为止未有相关文献的报道。前期研究工作发现,本菌株可以大量合成在香料工业中应用广泛的γ-癸内酯及其类似物,产量能够接近已报道的最高产量,具有较大的应用潜力。通过文献查阅了解到,多孔菌发酵过程中还可以产生有医疗价值的次生代谢产物,例如:萜类物质、真菌多糖、甘露醇、酚类等。为了更好地综合开发菌株LH-1,本文对其进行了摇瓶发酵条件下代谢产物方面的研究,主要包括对菌株LH-1的全基因测序和相关代谢过程的基因组学分析;菌株LH-1摇瓶发酵产萜类物质的条件优化;菌株LH-1菌体细胞内萜类物质提取方法优化;发酵液上清和菌体等的粗提物的生物活性以及纯化等。主要研究的结果如下:对菌株LH-1和一株药用多孔菌桦树多孔菌的18s rRNA进行了提取、扩增和测序,比对后发现两者的序列覆盖率达到99%,相似性达到了 98.55%,根据18s rRNA构建进化树后也表明两者具有很近的进化方面的亲缘关系。又对菌株LH-1进行了全基因测序和基因组学分析,在菌株LH-1中查找到了其中关于前期实验Y-癸内酯生成有关的基因簇,而且在菌株还找到了与萜类合成相关的一部分关键基因,由此推测出,菌株LH-1也可以合成萜类物质。对菌株LH-1的进行前期的摇瓶发酵尝试,发现菌株确实可以合成萜类物质,且在摇瓶发酵过程中,发酵到第六天的时候,上清中的萜类物质达到最大的积累量,并且菌体的生长也进入到一个中后期,之后菌体的积累速度趋于平稳。所以综合成本等因素确定了,LH-1在摇瓶发酵生产萜类物质中,到第六天是最佳收获时间。进而对LH-1摇瓶发酵生产上清萜类物质的常见碳源和氮源进行了筛选,筛选结果显示,最佳碳源是蔗糖,最佳氮源是蛋白胨和酵母粉的混合氮源,两者配合使用上清三萜产量可达1.5 g/L左右。对菌株LH-1的菌体萜类物质进行了超声辅助法提取条件的探索。根据已报道的相关文献,综合考虑实验成本与安全性后,决定使用乙醇溶液为提取剂,利用超声辅助法对菌体的萜类物质进行提取。并对超声辅助法提取过程的液料比、提取液乙醇浓度、超声提取时超声时间、超声功率等相关因素进行了优化。结果显示在液料比为30:1,乙醇浓度为70%,超声时间是30 min,超声功率为360 W时提取率达到最大,可达6.4%左右。对上清以及菌体的粗萜提取物的抗癌活性进行了前期的探索。实验中对粗提取物进行了抗癌活性的筛选,最后结果显示LH-1的提取物对实体瘤的活性抑制作用非常小,但是对血液瘤U937和HL60活性却有良好的抑制作用。此外,在使用研钵研磨菌体的过程中,如果能保证在低温环境下进行,最后的提取物对癌细胞活性的抑制效果会更加明显。
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