胃癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一,其发病率在肿瘤中位居第五名,其死亡率更是高居第二名,导致患者死亡的主要原因是胃癌细胞的侵袭以及转移。胃癌的主要转移方式是淋巴转移,新生淋巴管生成则是胃癌出现淋巴转移的前提。因此研究胃癌淋巴管新生机制对于探寻新的治疗靶点、抑制淋巴转移具有重要意义。肿瘤微环境是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、以及浸润的免疫细胞等共同组成。炎性细胞的浸润在胃癌侵袭及转移过程中起着非常重要的作用,巨噬细胞则是胃癌微环境中最主要的炎症细胞之一。在胃癌间质中的巨噬细胞是由外周血循环中的单核细胞分化而成,其激活方式包括经典激活和替代激活。经典激活是指单核细胞分化为起促炎作用的M1型巨噬细胞,替代激活是指单核细胞分化为可以分泌抗炎因子并参与组织修复的M2型巨噬细胞。浸润在肿瘤微环境的巨噬细胞称为TAMs(Tumor-associated Macrophages,肿瘤相关巨噬细胞),其表现出M2样巨噬细胞表型并与多种肿瘤的进展密切相关。作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所,肿瘤微环境内存在许多因素参与肿瘤组织与免疫系统的相互作用。在肿瘤微环境中,IL-6是一个强有力的、多效性的炎性细胞因子,其所构成的抑制性肿瘤免疫微环境为肿瘤发生、进展和转移提供了基础。本研究以胃癌为研究对象,探讨胃癌微环境中IL-6、TAMs与淋巴转移的关系。研究目的:1.了解TAMs与IL-6、VEGF-C在胃癌组织中的分布情况并分析其与胃癌进展及淋巴转移的关系2.建立IL-6诱导TAMs细胞模型并初步分析TAMs对胃癌进展及淋巴转移的影响研究方法:1.胃癌患者胃癌组织及正常胃组织中IL-6、TAMs、VEGF-C及淋巴管密度的检测及分析收集2008年7月至2009年7月期间在西南医院普通外科行胃癌手术的40名胃癌患者的胃癌组织,进行常规石蜡包埋。石蜡切片分别用兔抗人IL-6单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体、兔抗人VEGF-C多克隆抗体和鼠抗人D2-40单克隆抗体,行免疫组化双标染色。结果采用nikon光学显微镜分析,100倍光镜下确定5个着色密集区域,200倍光镜下计数,取其平均数。结合患者临床资料,分析年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤侵袭胃壁深度、tnm分期、淋巴转移和有无远处转移对il-6、肿瘤相关巨噬细胞、vegf-c和新生淋巴管表达的影响。采用线性回归分析胃癌组织中il-6、肿瘤相关巨噬细胞、vegf-c和新生淋巴管的相关性。取il-6、cd68、vegf-c和d2-40表达的中位数进行分组,并行术后随访,做生存分析。2.建立il-6诱导单核细胞向m2样表型的tams极化模型从正常人外周血单个核细胞(pbmc)中磁珠分离cd14+的单核细胞,加入含100ng/mlm-csf的培养液培养6天,流式细胞仪检测巨噬细胞表型cd68和cd11b,然后分别加入不同浓度的il-6刺激24h后,提取细胞rna,采用rt-pcr检测巨噬细胞表型因子及与淋巴管新生密切相关因子vegf-c基因水平的变化。3.il-6诱导的tams对胃癌细胞株mgc803侵袭转移能力的影响分别用il-6+m-csf诱导的肿瘤相关巨噬细胞和m-csf诱导的未分化巨噬细胞及只加培养基的空白对照组与胃癌细胞株mgc803同培养48h后,结晶紫染色,光学显微镜观察胃癌细胞的侵袭数量并计数。研究结果:1.il-6、tams、vegf-c及d2-40在胃癌组织及正常胃组织中的表达情况。统计学分析结果显示胃癌组织中il-6、tams、vegf-c及d2-40的表达明显高于正常胃组织(48.0±10.3vs11.1±2.3、26.0±5.5vs5.9±1.6、26.7±6.5vs9.7±2.8、7.6±3.8vs2.5±1.2,p<0.05)。2.胃癌组织中il-6、tams、vegf-c表达、淋巴管密度与临床病理特征的关系胃癌组织中il-6、tams、vegf-c表达、淋巴管密度与肿瘤侵袭胃壁深度有关,肿瘤侵袭胃壁浆膜层组(t3+t4组)表达高于肿瘤未侵袭浆膜层组(t1+t2组)(50.1±8.8vs41.5±12.2、27.3±5.1vs22.2±5.1、28.0±6.3vs22.8±5.8、8.3±3.9vs5.5±2.6,p<0.05);胃癌组织中il-6、tams、vegf-c表达、淋巴管密度与临床tnm分期有关,晚期组(iii+iv期)表达高于tnm早期组(i+ii组)(57.3±2.6vs38.6±5.3、31.1±1.9vs21.0±2.2、32.6±2.9vs20.8±2.3、10.6±2.9vs4.7±1.6,p<0.05);胃癌组织中il-6、tams、vegf-c表达、淋巴管密度与淋巴转移有关,有淋巴结转移组表达高于无淋巴结转移组(55.2±6.4vs39.2±6.7、29.9±3.8vs21.3±3.0、31.3±4.5vs21.2±3.4、9.6±2.9vs5.2±3.3,p<0.05)。但胃癌组织中il-6、tams、vegf-c表达、淋巴管密度与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及远处转移无关。3.胃癌组织中il-6、tams、vegf-c及淋巴管密度的相关性。胃癌中il-6的表达与tams表达呈正相关(r=0.941,p<0.05);tams表达与vegf-c呈正相关(r=0.911,p<0.05),vegf-c表达与淋巴管密度呈正相关(r=0.741,p<0.05)。4.il-6、tams、vegf-c及淋巴管密度及与胃癌预后的关系il-6高表达组、cd68高表达组、vegf-c高表达组及d2-40高表达组1年累积生存率为70.0%、70.0%、70%、65.0%;il-6低表达组、cd68低表达组、vegf-c低表达组及d2-40低表达组1年累积生存率为90.0%、90.0%、90.0%、95.0%,两者比较,差异有统计学意义(χ2=4.410、χ2=4.075、χ2=4.353、χ2=4.705,p<0.05)。5.il-6对tams的诱导作用用m-csf和完全1640培养基培养磁珠阳选的健康成人外周血单核细胞6天后,再加入不同浓度的il-6培养24小时。提取诱导细胞的rna,采用rt-pcr检测il-10、il-12、vegf-c及tgf-β变化情况,结果发现:m-csf+il-6组巨噬细胞il-10、vegf-c和tgf-β表达高于m-csf组(1.1±0.21vs0.1±0.01、1.1±0.04vs0.1±0.01、0.9±0.32vs0.1±0.02,p<0.05),而il-12的表达低于m-csf组(0.1±0.02vs1.0±0.39,p<0.05)。结果显示il-6可成功诱导巨噬细胞分化为tams,且tams可高表达与淋巴管生成密切相关的因子vegf-c和与肿瘤进展密切相关的转化生长因子tgf-β。6.由il-6诱导的tams对胃癌细胞侵袭转移能力的影响胃癌细胞株mgc803分别与只加dmem培养基的空白对照组、含有m-csf诱导的未分化巨噬细胞培养基的阴性对照组及含有il-6+m-csf诱导的肿瘤相关巨噬细胞培养基的实验组共培养48小时,结晶紫染色后采用光学显微镜计数,结果发现实验组中胃癌细胞穿透基质胶的数量明显多于阴性对照组和空白对照组(124.0±8.9vs68.7±12.1vs67.0±7.5,p<0.05)。研究结论:1.胃癌组织及正常胃组织中il-6、tams、vegf-c及d2-40均有表达,且胃癌组织中的表达显著高于正常胃组织。胃癌组织中il-6、tams、vegf-c表达、淋巴管密度与胃癌侵袭深度、淋巴结转移及tnm分期有关。2.胃癌微环境中il-6、tams、vegf-c及淋巴管密度相互之间存在显著正相关关系,并且与胃癌患者预后相关。高表达il-6、tams、vegf-c及淋巴管密度增多患者预后较差。提示il-6在tams极化、新生淋巴管生成及胃癌进展中具有重要作用。3.il-6可成功诱导巨噬细胞分化为具有m2样表型的tams,tams高表达与淋巴管生成密切相关的VEGF-C,后者作用于间质中的淋巴管内皮细胞,导致新生淋巴管生成;间质中TAMs数量增多,胃癌细胞侵袭能力增强。提示IL-6通过诱导巨噬细胞M2样极化促进了胃癌的淋巴转移。