第一部分：高三尖杉酯碱联合阿克拉霉素在体内外对急性髓细胞白血病细胞的协同杀伤作用研究目的：探讨高三尖杉酯碱与阿克拉霉素在体内外对AML细胞株细胞及原代AML细胞的杀伤作用及作用关系。方法：采用MTT法检测不同浓度HHT、ACR及按一定浓度比联合HHT和ACR对AML细胞生长的抑制作用。采用流式细胞仪Annexin V/PI双染色法、Hochest染色法检测不同浓度HHT、ACR及按一定浓度比联合HHT和ACR对AML细胞株细胞及原代AML细胞的诱导凋亡作用。采用CalcuSyn软件分析HHT与ACR在抑制AML细胞增殖及诱导凋亡上的作用关系。构建AML细胞荷瘤小鼠模型用于体内研究。当瘤体体积达到100-120mm3时随机分入对照组、HHT治疗组、ACR治疗组及HHT联合ACR治疗组。入组后监测瘤体大小。采用原位细胞凋亡检测试剂盒进行TUNEL染色检测瘤体组织原位凋亡。采用Micro-PET扫描对对照组及药物处理组小鼠体内瘤体活性进行实时观察。统计学分析,单一变量两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。Kaplan-Meier法进行生存分析。以p值<0.05认为具有统计学差异。结果：(1)实验浓度HHT对THP-1细胞(急性单核细胞白血病细胞株)、Kasumi细胞(急性粒细胞白血病细胞株)的生长均具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。(2)实验浓度ACR对THP-1细胞、Kasumi细胞的生长亦具有明显抑制作用,并呈浓度依赖性。(3)实验浓度HHT、ACR均能抑制原代AML细胞生长,随浓度增加,抑制作用增强。(4)1：2.5摩尔浓度比联合HHT与ACR能协同抑制THP-1细胞、Kasumi细胞及原代AML细胞的生长,并能协同诱导其凋亡。(5)采用THP-1细胞能成功构建荷瘤小鼠模型。HHT治疗、ACR治疗及联合HHT和ACR治疗均能延长THP-1荷瘤小鼠瘤体倍增时间。联合治疗较单药治疗能更明显地延长THP-1荷瘤小鼠瘤体倍增时间。联合HHT与ACR治疗组小鼠瘤体组织细胞凋亡较单药治疗组明显增加。(6)Micro-PET扫描结果显示HHT联合ACR治疗组THP-1荷瘤小鼠瘤体代谢活性较用药前有所下降。(7)仅联合HHT和ACR治疗后能延长THP-1荷瘤小鼠的生存时间。小结：(1)一定浓度比联合HHT和ACR在体外可协同抑制THP-1细胞、Kasumi细胞和原代AML细胞增殖及诱导其凋亡。(2)与单药相比,HHT联合ACR在体内可更明显地抑制THP-1荷瘤小鼠瘤体增殖及诱导凋亡,并可能更明显地抑制荷瘤小鼠体内的肿瘤活性。(3)体内研究显示HHT与ACR联合治疗可改善THP-1荷瘤小鼠的生存。第二部分：高三尖杉酯碱联合阿克拉霉素协同杀伤急性髓细胞白血病细胞的分子机制研究目的：探讨高三尖杉酯碱联合阿克拉霉素协同杀伤急性髓细胞白血病细胞的分子机制,为AML靶向联合治疗方案的设计提供实验依据。方法：采用Agilent单通道表达谱芯片筛选对照组、HHT、ACR、HHT联合ACR作用THP-1细胞后差异表达的基因。Real-Time PCR检测目的基因m RNA表达水平对芯片结果进行验证。Western Blot检测Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白表达变化、WNT通路关键蛋白、PI3K/AKT通路关键蛋白表达变化。为进一步验证靶向抑制WNT3a及AKT后能否模拟HHT与ACR对THP-1细胞的协同杀伤作用,我们采用脂质体转染技术转染WNT3a的si RNA干扰片段以沉默THP-1细胞WNT3a基因。再分别采用MTT法及流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测WNT3a干扰后联合HHT或AKT抑制剂后对THP-1细胞生长抑制及诱导凋亡作用。进一步我们采用GSK-3p抑制剂上调THP-1细胞P-catenin表达,观察是否能逆转HHT联合ACR对THP-1细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。由于WNT通路及PI3K/AKT通路在AML-LSC中存在异常活化,尤其是WNT通路中的β-catenin在AML-LSC自我更新中具有尤为重要的作用。我们的研究中HHT与ACR联合可协同抑制WNT信号及PI3K/AKT信号,并可共同下调β-catenin,因此我们采用流式细胞术初步分析了HHT、ACR单用及联合对AML患者骨髓单个核细胞中CD34+／CD38-干／祖细胞群的诱导凋亡作用,并采用CalcuSyn软件进行协同效应分析。结果：(1)芯片筛选结果显示多种WNT基因及PIK3CA基因在HHT组、ACR组和联合用药组表达存在差异。(2)定量PCR结果也证实36nM HHT作用THP-1细胞和Kasumi细胞1h后WNT3A基因m RNA表达先上调随后回落至用药前水平,而90nM ACR作用THP-1细胞和Kasumi细胞1h-12h后WNT3A基因m RNA表达明显下调,联合HHT和ACR作用1h-12h后WNT3A基因m RNA表达也明显下调。P-catenin基因m RNA表达变化也呈类似结果。HHT、ACR、HHT联合ACR作用THP-1、Kasumi细胞1h-12h后GSK-3p基因m RNA表达变化无明显规律。(3)实验浓度HHT及ACR单独作用均可激活Caspase9、Caspase3并引起PARP剪切。HHT联合ACR可更明显激活Caspase9、Caspase3及PARP。(4)实验浓度HHT作用3h即可下调THP-1细胞和Kasumi细胞Bcl-x1、Mcl-1蛋白表达并上调Bax蛋白,但HHT对两种细胞Bcl-2蛋白表达无明显影响。ACR则在短时间内明显下调Bcl-2蛋白和Bcl-x1蛋白表达,而在作用较长时间才下调Mcl-1蛋白及上调Bax蛋白。(5)36nM HHT作用3h-24h后对THP-1细胞和Kasumi细胞WNT3a蛋白表达无明显影响,但作用3h即可明显下调PI3K110、P-AKT和β-catenin蛋白并上调GSK-3p蛋白。90nM ACR作用两种AML细胞株细胞3h后即明显下调WNT3a蛋白表达及(3-catenin蛋白,但对P13K110、P-AKT及GSK-3p蛋白表达无明显影响。36nM HHT联合90nM ACR可同时抑制THP-1细胞、Kasumi细胞WNT3a. β-catenin、PI3K110及P-AKT蛋白表达。(6)沉默THP-1细胞WNT3a基因后再联合HHT或AKT抑制剂能增加HHT及AKT抑制剂对THP-1细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。一定浓度比联合AKT抑制剂与ACR亦能协同抑制THP-1细胞生长并协同诱导其发生凋亡。(7)采用GSK-3β抑制剂部分上调THP-1细胞β-catenin后能部分逆转实验浓度HHT联合ACR对THP-1细胞的生长抑制作用,但对HHT、ACR单药引起的生长抑制作用无明显改善。GSK-3p抑制剂作用对HHT、ACR、HHT联合ACR对THP-1细胞的诱导凋亡作用无明显逆转。(8)实验浓度HHT联合ACR可能可以协同诱导AML患者骨髓中CD34+／CD38-细胞凋亡。小结：(1)实验浓度HHT作用AML细胞株细胞不同时间对WNT3a基因、β-catenin基因表达无明显下调,而ACR及HHT联合ACR作用后明显下调WNT3a基因和β-catenin基因mRNA的表达,与芯片结果一致。(2)HHT及ACR最终可能通过Caspase9激活的内源性凋亡途径而在体外诱导AML细胞株细胞发生凋亡。HHT联合ACR能更明显激活Caspase9.Caspase3。(3)HHT可上调THP-1细胞及Kasumi细胞Bax蛋白表达但对Bcl-2蛋白无明显影响；ACR则可明显下调THP-1细胞及Kasumi细胞Bcl-2蛋白表达。HHT联合ACR能更明显地下调AML细胞株细胞Bcl-2蛋白、Bcl-xl蛋白表达,同时上调Bax蛋白表达。(4)HHT可抑制AML细胞株细胞及原代AML细胞的PI3K/AKT通路活性,并可能进一步抑制其下游信号分子如Mcl-1,同时上调Bax蛋白而诱导AML细胞株细胞发生凋亡。HHT还可能通过减低AKT活性后解除其对GSK-3β的抑制而间接下调P-catenin蛋白表达。(5)ACR可抑制AML细胞株细胞和原代AML细胞WNT3a、β-catenin蛋白的表达,并可能通过进一步抑制WNT通路下游靶分子CyclinDl、C-myc而发挥对AML细胞株细胞的生长抑制作用及诱导凋亡作用。(6)HHT联合ACR可同时抑制AML细胞株细胞及原代AML细胞的P13K/AKT信号及WNT/β-catenin信号。(7)HHT可抑制THP-1荷瘤小鼠瘤体细胞PI3K、P-AKT、β-catenin蛋白表达。ACR可抑制THP-1荷瘤小鼠瘤体细胞WNT3a、β-catenin蛋白表达。HHT联合ACR可同时抑制THP-1荷瘤小鼠瘤体细胞P13K、P-AKT、WNT3a、β-catenin蛋白表达。(8)沉默WNT3a可明显增加HHT或AKT抑制剂对THP-1细胞的杀伤作用。采用GSK-3β抑制剂上调P-catenin表达后可能部分逆转HHT联合ACR对THP-1细胞生长的抑制作用。(8)HHT联合ACR在体外也可能协同诱导AML患者骨髓中的白血病干／祖细胞凋亡。结论：实验浓度HHT与ACR联合在体外能协同抑制AML细胞株细胞及原代AML细胞生长,并协同诱导其凋亡。实验浓度HHT与ACR联合在体内也可能通过诱导AML细胞荷瘤小鼠瘤体细胞凋亡而减慢瘤体增长速度,从而延长小鼠生存时间。HHT可能通过抑制AML细胞的PI3K/AKT活性而抑制其生长并诱导凋亡。ACR可能通过抑制AML细胞的WNT/β-catenin通路活性而抑制其生长并诱导凋亡。HHT联合ACR可能通过同时抑制PI3K/AKT通路及WNT/β-catenin通路而发挥协同杀伤AML细胞的效应。β-catenin作为上述两条信号通路的共同作用分子可能是HHT与ACR协同杀伤AML细胞的分子靶点之一。