目的:脑血管病是我国居民死亡的首要原因和造成成人残疾的第一原因,其中以缺血性脑血管病最为常见。虽然神经元不能再生,但是临床资料显示,存活的脑卒中患者,均显示出不同程度的功能恢复,提示脑组织具有自我修复能力。近年来,科学家们不断发现神经可塑性在脑卒中患者和脑梗死动物模型中起到功能恢复的作用。神经可塑性从组织结构层面来讲指的是轴突、树突的分支,树突棘的密度,突触数量和大小,受体的密度和某些大脑区域神经元的数量等。这些结构共同构成了神经网络和脑卒中后的功能恢复基础。因此,如何提高脑梗死后神经的可塑性为临床治疗脑梗死提供了新的治疗策略。Sonic hedgehog(Shh)信号通路是一高度保守的分泌性糖蛋白,是hedgehog蛋白家族三大成员Sonic hedgehog(Shh),Desert hedgehog(Dhh)和Indian hedgehog(Ihh)之一。当Shh蛋白与Ptch结合后,诱导细胞内Gli家族转录因子介导的促存活反应。脊椎动物的Gli家族包括Gli1、Gli2和Gli3,其激活后由胞浆转位至胞核发挥转录因子的作用。研究显示Shh信号通路在胚胎期中枢神经系统发育过程中起重要作用,它可以调控细胞的分化和增殖,同时它可以在脑损伤后诱导神经干细胞再生,参与血管重构。我们前期实验结果显示,脑梗死后Shh信号通路重新激活,皮层缺血组织的Shh/Ptch1/Gli1表达较对照组显著增加,特异性阻断Shh/Ptch1/Gli1信号通路后,神经功能损伤加重,脑梗死体积增大,提示Shh信号通路在脑卒中后神经保护治疗中起重要作用。生长相关蛋白43(Growth Associated Protein 43,GAP43)可以高水平表达于神经元轴突发育过程中,是轴突和突触前的重要组成部分。GAP43在大脑发育、脑损伤或脑缺血过程中可被用作为一个新的轴突生长的可靠的标志。脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是广泛分布于中枢神经系统内的蛋白质。BDNF在中枢神经系统发育过程中,对神经元的分化、生长及存活发育起重要作用,并且其能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。因此BDNF是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需的蛋白质。正丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)又名丁苯酞,是我国自主研发的治疗缺血性脑血管病的国家一类新药。NBP最初是由芹菜籽中提取而来。以往的研究已经证明NBP具有较强的抗脑缺血作用:明显改善脑缺血区微循环和血流量,增加缺血区毛细血管数量,缩小梗死面积,减轻脑水肿,抑制神经细胞凋亡,改善能量代谢,抑制血栓形成及血小板聚集等。但是有关NBP对卒中后神经功能恢复的机制尚不清楚。本实验在实验性小鼠局灶性大脑中动脉皮层梗死(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)模型的基础上观察脑缺血后应用NBP,从手术后急性期至术后4周脑缺血损伤后其神经保护作用,NBP对Shh/Ptch1/Gli1通路和GAP43和BDNF因子的影响以及NBP对于轴突和树突,树突棘的影响。方法:实验分为三部分:实验一,NBP的脑保护作用研究;实验二,NBP治疗组的Shh/Ptch1/Gli1及GAP43和BDNF含量变化;实验三,NBP对于轴突与树突和树突棘神经可塑性观察。实验一:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组(Sham)、溶剂对照组(Vehicle)、NBP小剂量(20mg/kg)组(NBP-L)、及NBP大剂量(40 mg/kg)组(NBP-H)。制作小鼠局灶性大脑中动脉皮层梗死模型(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)。制备梗死模型1小时后立即于腹腔给予NBP(20 mg/kg或40 mg/kg),或溶剂Tween-80(0.5%)。手术分为急性期和慢性期两组。急性期于术后第3天至5天,7天至9天,14天至16天,慢性期于术后第14天至16天及28天至30天分别进行Rotarod Test神经功能评分。实验二:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组(Sham)、溶剂对照组(Vehicle)、NBP小剂量(20mg/kg)组(NBP-L)、及NBP大剂量(40 mg/kg)组(NBP-H)。干预组采取腹腔给药。采用免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC),免疫荧光共聚焦技术(Confocol Technique)检测GAP43是否表达及表达位置,蛋白印迹法(Western Blot)测定Shh/Ptch1/Gli1以及GAP43和BDNF的蛋白水平。实验三:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组(Sham)、溶剂对照组(Vehicle)、NBP小剂量(20mg/kg)组(NBP-L)、及NBP大剂量(40 mg/kg)组(NBP-H)。干预组采取腹腔给药。采用神经元顺行示踪剂(Biotin dextran amine,BDA)研究NBP对皮层组织神经轴突生长(axonl sprouting)的影响。采用高尔基染色法(Golgi-stain)观察NBP对树突和树突棘的影响。结果:1采用Rotarod评价小鼠神经功能行为学。手术分为急性期和慢性期两组。急性期和慢性期的Vehicle组、NBP小剂量(20mg/kg)组(NBP-L)、及NBP大剂量(40 mg/kg)组(NBP-H)小鼠均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。急性期时:NBP小剂量组与溶剂对照组比较发现术后第4天,5天,7天,8天,9天,14天,15天,16天有差异,差异具有统计学意义(Vehicle vs.NBP-L:4天:38.37±3.53 vs.51.14±3.31,P<0.05;5天:43.74±3.34 vs.56.67±3.96,P<0.05;7天:44.48±2.69 vs.66.16±4.39,P<0.05;8天:44.42±2.28 vs.63.41±3.68,P<0.05;9天:39.24±2.95 vs.69.94±5.14,P<0.05;14天:38.97±4.33 vs.57.24±3.92,P<0.05;15天:36.25±4.16 vs.50.62±4.28,P<0.05;16天:33.19±5.27 vs.51.14±5.22,P<0.05)。大剂量组与溶剂对照组比较发现术后第4天,5天,7天,9天,14天有差异,差异具有统计学意义(Vehicle vs.NBP-H:4天:38.37±3.53 vs.48.51±3.52,P<0.05;5天:43.74±3.34 vs.55.32±3.93,P<0.05;7天:44.48±2.69 vs.66.37±4.87,P<0.05;9天:39.24±2.95 vs.69.94±5.14,P<0.05;14天:38.97±4.33 vs.56.73±4.93,P<0.05)。慢性期时:NBP小剂量组与溶剂对照组比较发现术后第14天,15天,16天,28天,29天,30天有差异,差异具有统计学意义(Vehicle vs.NBP-L:14天:22.30±1.55 vs.31.45±2.34,P<0.05;15天:31.42±2.07 vs.42.28±2.56,P<0.05;16天:28.88±2.28 vs.39.11±2.30,P<0.05;28天:31.24±2.65 vs.41.61±2.37,P<0.05;29天:31.66±2.73 vs.42.60±2.57,P<0.05;30天:31.94±2.89 vs.52.70±3.29,P<0.05)而慢性期NBP大剂量组与溶剂对照组比较没有统计学差异。2免疫组化法和免疫荧光共聚焦技术检测到GAP43在脑梗死后可以表达。3 NBP对Shh/Ptch1/Gli1通路及GAP43和BDNF表达的影响:NBP低剂量组NBP-L与溶剂对照组相比,Gli1在3天,7天蛋白水平的表达明显增高(P<0.05),Ptch在7天,14天蛋白水平的表达明显增高(P<0.05),Shh在14天的时候蛋白水平的表达明显增高(P<0.05),BDNF在3天,14天蛋白水平的表达明显增高(P<0.05);Ptch1在14天蛋白水平的表达明显增高(P<0.05),BDNF在3天,14天蛋白水平的表达明显增高(P<0.05)。GAP43总蛋白与溶剂对照组比较没有统计学差异。此外在测量低剂量组NBP-L和高剂量组NBP-H胞浆蛋白中发现Gli1在14天和28天与溶剂对照组相比蛋白水平的表达明显增高(P<0.05)。4高尔基染色发现NBP-L组较溶剂对照组在树突和树突棘的数量和形态上有明显变化。神经顺行示踪剂发现NBP-L组较溶剂对照组在轴突再生上有明显变化。结论:给予NBP进行脑梗死干预后,低剂量组改善神经功能行为学评分的效果更加明显;进一步的研究表明NBP上调了Shh/Ptch1/Gli1和BDNF表达水平,对脑缺血后脑组织神经可塑性具有保护作用,为NBP临床应用提供了理论基础。