【摘 要】
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目的 构建含腺苷酸环化酶毒素（Adenylate Cyclase Toxin,ACT）重复子毒素（Repeats-in-toxin,RTX）域（RTX751）和赖氨酸酰基转移酶（Cyclolysin activating lysine acyltransferase,CyaC）的双质粒表达系统,表达纯化RTX751蛋白。利用百日咳鲍特菌小鼠气雾感染模型来评价RTX751免疫效果,为研发新一代无细胞
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目的 构建含腺苷酸环化酶毒素（Adenylate Cyclase Toxin,ACT）重复子毒素（Repeats-in-toxin,RTX）域（RTX751）和赖氨酸酰基转移酶（Cyclolysin activating lysine acyltransferase,CyaC）的双质粒表达系统,表达纯化RTX751蛋白。利用百日咳鲍特菌小鼠气雾感染模型来评价RTX751免疫效果,为研发新一代无细胞百日咳（acellularpertussis,aP）疫苗提供一些思路。方法 第一部分为表达纯化RTX蛋白。①利用PCR从CS菌株中克隆RTX751（ACT的第751到1706氨基酸残基）基因片段及公司合成CyaC基因片段,②将两个基因分别克隆进pET-28（a）和pCDFDuet-1表达载体,构建pET-28a-RTX751和pCDFDUet-1-CyaC重组表达质粒,并将两个重组质粒转化进同一株大肠杆菌BL21（DE3）。利用镍柱纯化重组RTX751蛋白,获得RTX751蛋白,并进行抗原特异性及乙酰化位点检测。第二部分为评价RTX751的免疫保护效果。首先用1/40aP+RTX和1/80aP+RTX与1/40aP、1/80aP、RTX、氢氧化铝分别对C57BL小鼠行腹腔两针免疫,间隔21天且每针免疫前进行尾静脉采血分离血清,测百日咳毒素（Pertussis toxin,Pt）、丝状血凝素（Filamentous hemagglutinin,Fha）、百日咳粘附素（Pertussis adhesin,Prn）、RTX抗原的特异性IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平;然后,在第二针免疫后28天用1×1011/CPU/mL对小鼠进行连续30min气雾感染;最后计肺、气管细菌菌落数及细菌清除曲线下总面积（3、7、14、28天）,对感染后肺、脾脏组织的IFN-γ,IL-17,IL-5、TNF-α细胞因子进行分析。最后用Grphpad prism7.0软件对结果进行统计分析。结果 第一部分成功构建双质粒表达系统,且成功表达RTX751蛋白和CyaC蛋白。通过镍柱纯化获得纯度较高的RTX751蛋白,且经Western Blot检验,蛋白抗原特异性较好。Lys983和Lys860位点未被乙酰化。第二部分,血清抗体分析表明,1/40aP+RTX组PT、FHA的特异性总IgG水平显著高于 1/40aP 组（P<0.01）;1/40aP+RTX 组 PT、FHA、PRN 的 IgG2a 水平显著高于 1/40aP 组（P<0.01）;1/80aP+RTX 组 PT、FHA、PRN 的特异性总 IgG 和 IgG2a显著高于 1/80aP 组（P<0.05）;1/80aP+RTX751 组 PT、PRN 的 IgG1 显著高于 1/80aP组（P<0.01）;1/80aP+RTX 组 RTX 的 IgG2a 显著高于 1/40aP+RTX 组（P<0.05）;1/80aP+RTX751组PT、FHA 的 IgG2a/IgG1 显著大于 1/80aP 组（P<0.01）;RTX 组RTX的IgG1显著高于Alum组。感染后第7天,1/40aP+RTX组肺部细菌数显著低于 1/40aP、1/80aP、1/80aP+RTX 组（P<0.01）;与 Alum 组相比,RTX 组呼吸道细菌菌落数无差异（P>0.05）。细胞因子分析结果表明,RTX加入aP疫苗能降低炎性因子的分泌。结论 本研究表明在适当剂量的aP疫苗中添加RTX能增强aP疫苗的保护效果。RTX具有较强的免疫原性和佐剂效应,能提高共同免疫抗原的抗体水平,能使aPV诱导的细胞反应类型从Th2向Th1/Th2混合型偏移,对细菌清除具有一定辅助作用。单独的RTX免疫小鼠,虽有一定的抗体产生,但对细菌清除无作用。
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