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NuMA(Nuclear Mitotic Apparatus protein)是第一个被鉴定出来在间期定位于细胞核,分裂期转移到中心体执行纺锤体组装及维持其稳定的蛋白。哺乳动物细胞内存在多种类似于NuMA分布的微管结合蛋白,其微管相关功能在间期被锁定于细胞核,在分裂期的不同时相维持微管聚合和解聚的动态平衡。曾长青教授基于这一现象分别于2000和2007年提出NuMA-like蛋白或细胞核微管结合蛋白群(Nuclear Microtubule Association Proteins,NuMAPs)的观点。 本课题组的主要研究方向是鉴定新的NuMAPs和NuMA isoforms,同时探索它们的生物学功能。 为了发现新的NuMAPs,课题组前期通过筛选2例自身免疫病人血清cDNA文库鉴定出一个候选蛋白MGC16169(后来被命名为TBCK)。免疫荧光,免疫印迹等实验表明TBCK是一个具有细胞周期特异性分布的胞质蛋白。在间期定位于细胞质,在分裂期与中心体、纺锤体和中体共定位。此外,TBCK在多数肿瘤组织和细胞系中相对于非肿瘤对照组表达较低。并且TBCK的过表达可阻滞细胞于S期,并抑制细胞的生长和迁移;RNAi实验显示降低TBCK的表达促进细胞的增殖。另外,针对TBCK的cDNA测序和正常/食管癌组织配对标本的RNA-seq数据结果表明,TBCK可编码长、短两类isoforms,短型isoforms呈现细胞特异性表达,而长型isoforms在肿瘤组织中呈低表达。最后,通过RNAi及双向电泳实验,共观察到17个具有统计学差异的与TBCK相关的蛋白。其中高尔基体组装关键蛋白NSFL1C与TBCK直接相互作用。 此外,设计不同引物进行特异PCR检测和sanger测序等技术确定了NuMA具有长(2)、中(2)、短(3)三类isoforms。短型NuMA的三个isoform虽然编码的蛋白完全一样,其mRNA可能由三个不同的启动子启动转录的。并且长、中型NuMA在细胞内分布类似,即间期定位于细胞核,分裂期定位于纺锤体;而短型NuMA在整个细胞周期都定位于细胞质。另外,尽管RNAi实验降低短型NuMA的表达对细胞增殖无显著影响,但过表达显著抑制细胞的生长和克隆形成能力,并且短型NuMA在所检测的肿瘤组织和细胞系中相对于非肿瘤对照组表达较低。此外,通过GST pull down实验还筛选出3个与短型NuMA有潜在相互作用的蛋白(Alpha-actinin-4,Alpha-actinin-1和Actin),其中Alpha-actinin-4对于肿瘤细胞的黏附与增殖有促进作用。下一步将采取免疫共沉淀实验验证短型NuMA与Alpha-actinin-4之间的直接相互作用关系。 最后,通过GST pull down实验筛选出18个与NuMA的coiled-coil结构域有潜在相互作用的蛋白,其中包含分子伴侣T-complex的三个亚基(alpha,epsilon和zeta),提示NuMA可能涉及T-complex作用。