论文部分内容阅读
恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是疟疾的病原体,每年可造成400万人死亡。P.falciparum进入人体后主要感染红细胞并在其中寄生繁殖。在这一阶段,疟原虫会表达分泌一些膜蛋白并转运展示在红细胞膜表面,比如红细胞膜表面蛋白PfEMP1,RIFIN,STEVOR等等。其中PfEMP1最为重要,因为它是红内期人体免疫系统识别清除恶性疟原虫最主要的抗原成分之一。PfEMP1属于一个多成员基因家族,其编码基因为var基因。在P.falciparum3D7中,var基因家族一共有60个成员。var基因的表达遵循排斥性表达原则,即同一时间内一个虫体只会表达一个var基因,而其余var基因处于沉默状态,并且在未知因素的刺激下,虫体会随机切换表达另一个var基因。这种表达策略能有效帮助P.falciparum逃避免疫系统的识别和清除,延长疟原虫在体内的生存时间。因此,充分理解阐明var基因排斥性表达机制具有十分重大的意义。这不仅能帮助更好的理解生物体基因转录调控的机制,更重要可以针对性设计疫苗或药物干扰或破坏排斥性表达机制,促进人体免疫系统清除疟原虫感染。 在本论文中,首先构建了基于T7RNA聚合酶的新型恶性疟原虫RNA转录系统,并尝试应用该系统来转录产生mRNA和长链非编码RNA(lncRNA)。发现在T7RNA聚合酶的C端引入侧翼蛋白序列会导致蛋白丧失活性,而在N端引入侧翼序列可以较好的保留蛋白活性。据此,将核定位信号融合到T7RNA聚合酶的N端并将该酶引入到P.falciparum中,免疫荧光检测发现其能较好的定位到细胞核内。 尝试用T7RNA聚合酶在P.falciparum中转录出可以翻译的mRNA。首先,在GFP编码区前面加入了Calmoduline5非转录区,在基因3末端加入polyA结果GFP并没有观察到荧光,但qPCR显示GFP的RNA已经成功转录出来。进一步采用灵敏度更高的荧光素酶报告基因,并尝试了三种加A信号polyA,HRP2-3和bGH,结果依然没有检测到转录产物。表明该系统产生的RNA不能被P.falciparum翻译系统所识别。 另一方面利用该系统表达了var基因反义lncRNA,发现对应的var基因由沉默转变为表达激活状态。对于该现象做了进一步更为详细系统的研究。结果发现,只有反义lncRNA才有激活对应var基因的能力,var基因正义的lncRNA没有此功能;反义lncRNA的外显子1区域决定了激活var的特异性,缺失保守的内含子区域不影响反义lncRNA的激活功能;lncRNA激活的var基因可以和内源的var基因共同存在于同一个虫体中,不需要遵守排斥性表达机制;var基因一旦被激活,其内含子的启动子活性也得到活化;外源lncRNA的表达水平与var基因的表达水平不存在正相关性。 通过RNA pulldown技术,捕获到与var基因反义lncRNA相互作用的RNA结合蛋白质Alba4,并重组表达纯化了该蛋白在体外再次进行RNA pulldown实验验证了两者存在相互作用。除此以外,还构建过表达Alba4质粒并转染P.falciparum,用RNA免疫共沉淀(RIP)从体内的角度再次确认Alba4与var基因lncRNA存在相互作用。这些结果表明Alba4是一个var基因反义lncRNA结合蛋白,参与到与lncRNA相关的活动中。 除上述工作,还试图了解组蛋白H3.3的突变体K36M/R对P.falciparum中组蛋白H3K36修饰的影响。构建了过表达H3.3及突变体K36M/R的质粒,并分别转染到P.falciparum中去,并在转染虫株中鉴定H3K36的甲基化修饰。与哺乳动物细胞不同的,没有发现组蛋白突变体对H3K36甲基化有明显的影响,没有出现预期的全局性甲基化缺陷。也检测了转染虫株中的var基因表达情况,也没有发现var基因表达谱出现全体激活的现象。两组数据表明在P.falciparum中组蛋白突变H3.3K36M对var基因表达情况没有产生明显影响。