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禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)已经给养禽业造成了巨大的损失,其中H5亚型AIV不仅能引起家禽的高死亡率,还可以由家禽传染给人,带来公共卫生方面的问题。疫苗在禽流感的防控中起着重要作用,为了改进疫苗的免疫效果或避免干扰免疫检测,新型基因工程疫苗研制是目前研究的主要方向。血凝素(HA)为AIV的主要保护性抗原,可以诱导机体产生免疫保护；而IL-6作为细胞因子可以增加疫苗的免疫效力,因此以鸡痘病毒共表达两个基因可能提供较好的免疫保护。目前流行的H5亚型AIV以clade2.3.2.1中的病毒为主,本研究以该分支的代表株ha为母本,构建了表达H5亚型AIV ha株HA基因及共表达ha-HA和鸡IL-6基因的重组鸡痘病毒,并且在SPF鸡上评价了疫苗免疫效力,为针对禽流感的鸡痘病毒载体活疫苗研制奠定了基础。1.表达H5亚型AIV HA基因及共表达AIV HA和鸡IL-6基因重组鸡痘病毒的构建利用overlap PCR通过同义突变将H5亚型AIV ha株HA基因中的BamHI位点消除,添加鸡痘病毒早期转录终止序列后将ha株HA基因克隆到鸡痘病毒转移载体p12LS中Ps启动子下游,获得转移载体p12LShaHA。将鸡IL-6基因与启动子PE/L相连插入到上述载体p12LShaHA中,使两基因反向串联,获得转移载体p12LShaHA-IL6。用脂质体转染法进行转染,利用蓝白斑筛选获得纯化的单表达AIV haHA(rFPV-haHA)或共表达AIV haHA和鸡IL-6(rFPV-haHAIL6)重组鸡痘病毒。提取重组鸡痘病毒的DNA, PCR证明HA基因和IL-6基因已插入鸡痘病毒基因组；IFA试验证明HA基因和1L-6基因能够在重组鸡痘病毒中表达；生长曲线试验表明,rFPV-haHA或rFPV-haHAIL6的生长速度与野生型鸡痘病毒类似。2. rFPV-haHA、rFPV-haHAIL6免疫效力试验10日龄SPF鸡随机分组,分别免疫105PFU/0.2mL rFPV-IL6、rFPV-haHA、 rFPV-haHAIL6、野生鸡痘病毒wt-PFV,0.2mL PBS,0.2mL H5亚型AIV油乳剂灭活疫苗ha(clade2.3.2.1)、lk(clade2.3.4)。在免疫0d及免疫后第6d、13d、20d称重；在免疫后第7d、14d、21d采集外周血,进行淋巴细胞活化试验及T淋巴细胞亚类分析,检测血清HI抗体。试验结果显示,重组病毒不影响鸡的增重。虽然rFPV-haHA、rFPV-haHAIL6诱导的抗体水平显著低于油苗组,但是rFPV-haHA、rFPV-haHAIL6诱导的淋巴细胞活化水平及流式细胞术检测CD4+/CD8+比值上升,细胞免疫水平提高。攻毒保护实验表明,rFPV-haHA、rFPV-haHAIL6免疫后对母本病毒的保护率为91.6%,对于另一分支AIV(Ik, clade2.3.4)的攻毒保护率分别为50%、58.3%,其中rFPV-haHAIL6免疫攻毒后的排毒率低于rFPV-haHA。