鸡球虫病是危害养鸡业的最重要寄生虫病之一，引起很高的发病率和死亡率，给养鸡业造成很大的经济损失。目前，药物防治是控制球虫病的主要手段，但随着抗球虫株的普遍产生及绿色食品概念的形成，人们期望用更好的手段取代之。从60年代起人们就开始研究抗球虫疫苗，目前已有4种活疫苗被养鸡业采用，但主要用于种鸡，且存在一定的缺陷。80年代末，人们开始研究基因工程亚单位疫苗，并已获得了部分保护效果。本课题对E. tenella 5401基因进行了探索性研究，为进一步研究基因疫苗奠定基础。 用纯种E. tenella ZJ株孢子化卵囊5×10~4个／只接种15日龄无球虫雏鸡。接种后7天剖杀鸡只，取其盲肠，组织捣碎机打碎，用2mg／ml胃蛋白酶40℃下消化2小时，经蔗糖梯度离心，次氯酸处理，收集大量纯化卵囊，2.5％重铬酸钾中培养48小时，使卵囊孢子化。 以E. tenella ZJ株孢子化卵囊总RNA为模板进行RT-PCR。按照Danforth(1989)发表的基因序列合成引物，引物上下游各加上EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点，以便于插入载体中。PCR扩增产物与PGEM-T载体连接后，转化DH-5α感受态细胞，将酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序。结果表明，扩增得到的产物大小为881bp，ORF大小为864bp，与Danforth等(1989)报道的基因序列的同源性为99.8％，有两个部位的碱基发生了有义突变。与Danforth等报道的氨基酸序列同源性为99.3％。 用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切5401基因与克隆载体组成的重组质粒pGEM-T-5401，回收小片段；同时用相同的酶双酶切pET-30a质粒载体，二者连接后，转化E. coliBL21(DE3)，碱裂解法抽提质粒，Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定为阳性重组质粒，构建成表达载体pET-30a-5401。 球虫子孢子表面抗原5401(31kDa)在实验中以蛋白二聚体的形式进行表达。以pET-30a为原核表达载体，用IPTG可诱导5401基因在E. coli BL21(DE3)中的表达。SDS-PAGE表明，融合蛋白大小约为66.2kDa，而非推测的38.5 kDa，诱导6h的蛋白表达量即可达到较高水平，表达量约26.3％。采用鼠抗His一抗和鸡抗鼠二抗进行Western-blot，成功检测到了特异性蛋白条带。 将pET-30a-5401融合蛋白、融合蛋白+弗氏佐剂、融合蛋白+0.25mg／ml人参皂甙、融合蛋白+0.5mg／ml人参皂甙、融合蛋白+1.0mg／ml人参皂甙及正常对照组，按照每只鸡100μg融合蛋白的剂量进行首免，两周后加强免疫一次，免疫前及一免后每周心脏采血，检测细胞免疫和体液免疫水平，持续6周。结果表明：融合蛋白+0.5mg／ml人参皂甙、融合蛋白+弗氏佐剂免疫组具有良好的免疫原性。各免疫组于一免后第二周开始出现特异性抗体，随后开始上升，一免后第五周达到较高水平；淋巴细胞转化水平同样于一免后第五周达到最高值。试验结果表明，中、高剂量人参皂甙具有较好的免疫增强作用。 设立上述相同的组别及攻虫不免疫对照组、药物对照组、活卵囊免疫组，并用相同的方法和剂量进行免疫。加强免疫后一周每只鸡按6×10~4个卵囊的剂量口服攻虫，浙江大学硕士学位论文观察其免疫保护效果。结果表明:5401融合蛋白+弗氏佐剂免疫组鸡只的增重率、相对增重率、卵囊产量下降、病变积分下降、综合保护效果(ACI)数值最高、免疫保护性最好;其次是5401融合蛋白+l .Omg/耐GS免疫组。说明免疫佐剂可以协助融合蛋白提高免疫保护效果。 本研究以柔嫩艾美耳球虫ZJ株5401基因为外源目的基因，构建原核表达质粒pET一30a--5401，并转化￡coll BL21(DE3)，在点cO了了中得到高效表达，分离纯化表达的5401融合蛋白，进行免疫试验，并以弗氏佐剂和人参皂贰作为免疫增强剂，探讨其免疫应答规律和免疫保护效果。此类研究在国内未见报道，研究结果对于进一步开发基因工程苗以预防鸡球虫病具有重要意义。