基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸的构建和应用

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抗生素残留所引起的食品安全问题已经引起全世界的重视,各国针对食品中抗生素都设有最高残留限量。妥布霉素被广泛地用于治疗革兰氏阴性菌等微生物导致的感染,而在畜牧养殖和动物医疗中不加控制的使用导致其在动物源性食品中极易存在残留,对人类健康乃至生态环境都有巨大的潜在威胁。目前,传统的抗生素检测方法大多受限于仪器设备要求高、需要专业操作、分析时间长等不适合现场点应用,开发快捷、高效、灵敏的抗生素检测方法是具有迫切的需求。论文利用适配体和新型的纳米材料构建了一种双功能侧流层析试纸条,用于妥布霉素快速灵敏的检测。核壳式结构的铂修饰金纳米粒子(Au@Pt NPs)几乎保留了纳米金(AuNPs)的所有特性,同时具有Pt壳层超高的类过氧化物酶催化活性,在底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2存在下可迅速生成蓝色产物(即氧化型oxTMB)。催化反应所产生的蓝色信号比AuNPs固有的红色强度更加突出。在构建过程中,妥布霉素特异性适配体(Apt)与其互补探针(cDNA)的杂交双链体通过cDNA 5’末端的巯基化修饰固定在Au@Pt NPs的表面,形成Au@Pt NPs-cDNA-Apt复合物。当待测样品中存在妥布霉素时,Apt优先结合妥布霉素并与cDNA去杂交,Au@Pt NPs-cDNA随液体迁移,游离的cDNA进一步被检测线(T线)和控制线(C线)的固定探针DNA1和DNA2所捕获,使Au@Pt NPs在T线和C线上积聚。其中,DNA1和DNA2分别是cDNA的部分互补探针和完全互补探针。该试纸条提供两种不同的检测方案:一种仅由AuNPs的本征颜色所产生的红色(“低灵敏”模式),另一种由Au@Pt NPs催化底物所产生的更敏感的深蓝色(“高灵敏”模式)。首先,采用种子介导生长3步合成法制备Au@Pt NPs,并对其双功能性质进行研究。然后,检测试纸条的构建和组装,检测原理的探针设计验证通过后,进一步对影响试纸条检测的关键条件进行优化。最后,对试纸条的检测性能及模拟实际样品检测进行考察。主要研究结果如下:(1)制备得到核壳式结构的Au@Pt NPs,分散性良好,粒径均匀,大小在40±2 nm,具有很好的保留初始AuNPs的等离子体光学特性,同时具有很强的酶催化特性;(2)实验得到试纸最佳的检测条件:T线探针DNA1的浓度为5μmol·L-1、C线探针DNA2的浓度为7.5μmol·L-1、金标固定量为35μL、NC膜类型为Vivid 170、流动缓冲液为1%BSA+15×SSC、反应时间为5 min;(3)试纸体通过灵敏考察,两种模式下肉眼检出限分别为60 nmol L-1和5 nmol L-1,使用胶体金扫描仪或Image J软件进行定量分析,计算两种模式的检测限(LOD)分别为0.09 nmol L-1和0.02 nmol L-1;(4)所研制试纸条具有良好的检测特异性和贮存稳定性,并成功地应用于对不同的人工模拟样品中妥布霉素的检测,且检测限均低于欧盟规定的最大残留限量。本论文的研究为妥布霉素残留的现场点检测提供了一种高灵敏度、快速且经济的试纸条解决方案,该试纸条可以在两种模式下运行,实现检测性能的“按需”调整,具有更好的普适性和更广阔的应用前景。
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