第一部分nNOS通过改善mPTP开放程度参与缺血后适应的心肌保护作用心肌长期缺血时,心肌细胞所需的养分和氧气严重匮乏,活性氧和自由基的生成会大量增加,导致心肌组织不可逆的坏死和损伤。在长期缺血后,即使恢复心肌组织供血即心肌缺血再灌注(Ischemic reperfusion,IR),这一过程也能对心肌组织造成连续性的损伤,这种情况称为心肌缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion injury,IRI)。已有多项研究证实,缺血后适应(Ischemic Postconditioning,IPostC)能够显著改善缺血再灌注导致的心肌损伤。IPostC指再灌注之前几个短暂的缺血和再灌注的循环。IPostC可以通过激活再灌注损伤救助激酶(Reperfusion Injury Salvage Kinases,RISK)通路等内源性心肌保护机制,显著降低心肌梗死面积,达到保护心肌组织的目的。但是IPostC过程中涉及的分子机制错综复杂,目前仍未阐述清楚,有待进一步完善。既往研究发现,内源性NO及其合成酶(包括内皮型一氧化氮合成酶、神经元型一氧化氮合成酶以及诱导型一氧化氮合成酶)在心肌缺血过程中发挥着重要的保护作用。其中,神经元型一氧化氮合酶(nNOS)由于在不同病理条件下皆能发挥保护心肌细胞的作用而备受关注。在我们前期的研究中也发现:IPostC能够减轻线粒体的氧化应激水平、保持线粒体结构的完整性、改善心功能;然而nNOS的选择性抑制剂L-VNIO可以显著减弱IPostC的保护作用,提示在IPostC过程中,nNOS可能通过保护线粒体功能,从而达到保护心肌细胞的作用。线粒体中大量渗透性转换孔(mitochondrial Permeablity Transition Pore,mPTP)不可逆的开放是细胞死亡的特点之一,因此,我们对心肌细胞中nNOS对线粒体的保护作用,尤其是nNOS在后适应中对mPTP开放程度是否具有抑制作用进行了探讨。由于VDAC1是线粒体外膜上表达最丰富蛋白并且是mPTP的重要组成成分,我们还将分析nNOS是否可通过调控其表达来抑制mPTP开放,从而发挥心肌保护作用。目的:探讨IPostC过程中nNOS对线粒体的保护作用、nNOS对mPTP的开放程度及VDAC1的表达及活性的影响。方法:使用缺氧罐建立体外心肌细胞缺氧/复氧模型观察细胞形态变化;用JC-1荧光探针通过流式细胞仪测定缺氧复氧心肌细胞H9C2中线粒体膜电位的变化;用Calcein-AM荧光探针通过荧光显微镜观察缺氧复氧心肌细胞H9C2中线粒体渗透性转换孔的开放程度;用Langendorff灌流系统建立小鼠缺血再灌注以及缺血后适应模型,用TTC试剂测定心肌梗死面积;并应用免疫荧光技术检测模型中nNOS和VDAC1的表达。结果:缺血后适应中,nNOS参与减轻离体小鼠心脏的梗死面积;进行缺血后适应后,nNOS表达升高;线粒体去极化程度和线粒体膜渗透性转换孔开放程度均得到改善,而联合使用nNOS抑制剂L-VNIO后削弱了这种改善作用;缺血后适应也降低了VDAC1的表达,联合使用nNOS抑制剂L-VNIO后削弱了其降低程度。结论:nNOS参与缺血后适应,参与保护受损心肌并发挥降低线粒体膜电位去极化、改善mPTP开放程度的保护作用。这种保护作用可能是通过调节VDAC1表达实现。第二部分缺血后适应与缺血再灌注损伤组织中差异LncRNA的筛选及验证世界范围内,心肌缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion injury,IRI)的发病率和死亡率在一直居高不下,是导致心肌梗死患者预后较差的重要原因。缺血后适应(Ischemic post-conditioning,IPostC)能够有效对抗缺血再灌注损伤,保护缺血心肌。尽管在过去的数十年中,人们对IPostC发生发展的机制进行了深入探索,但仍未能阐述清楚。随着后基因组时代的到来lncRNAs逐渐成为研究的热点,近来发现lncRNAs在多种心血管疾病中具有重要作用。然而,与IRI相关的lncRNAs并未见报道。本文中,我们用基因芯片分析IPostC心脏组织模型与IRI心脏组织模型的lncRNAs表达特点,研究与IPostC发生发展相关的lncRNAs。本研究将有助于我们深入了解IPostC发生发展的机制并且可能为治疗IRI发现新的治疗标记物。目的;筛选并验证缺血再灌注损伤组织与缺血后适应组织之间差异表达的lncRNAs,研究其对缺血后适应组织的影响,初步揭示其在缺血后适应中的潜在作用机制。方法:(1)分别取缺血再灌注损伤组织和后适应组织各3份,使用LncRNA芯片技术分别检测缺血再灌注损伤组织和后适应组织LncRNAs的表达情况,以2倍以上变化且具有统计学意义(P<0.05)为判断标准,筛选出差异表达的LncRNAs;(2)综合NCBIRefSeq,UCSC,RNAdb,LncRNAs等数据库资源,对差异表达的LncRNA进行Gene Ontology、Pathways等初步生物信息学分析;(3)扩大样本量,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术,选取差异表达别倍率5及以上的LncRNA,对基因芯片结果进行验证。结果:(1)对芯片原始数据进行标准化处理和两组比较后,差异表达的LncRNAs为4240条,其中上调的LncRNAs2292条,下调的LncRNAs1848条;(2)GO(Gene ontology)分析显示:①细胞组分(cellular component,CC),这些差异表达的LncRNA主要位于胞外空间(extracelluar space)、胞外区域(extracellular region)以及细胞内(intracellular);②生物学过程(biological process,BP),这些差异表达的LncRNA主要参与免疫过程(immune system process),单-多细胞生物过程(single-multicellular organism process),应激反应(response to stimulus);③分子功能(molecular fuction,MF):其主要具有结合(binding)、蛋白结合(protein binding)以及离子结合(ion binding)等功能。Pathway分析显示,这些LncRNA主要参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、疟疾(malaria)、非洲锥虫病(A frican trypanosomiasis)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、趋化因子信号转导通路(chemokine signaling pathway)以及扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy)等信号通路;(3)扩大样本量至缺血再灌注组织8例,后适应组织8例,qRT-PCR发现在后适应组织中有34个有显著差异表达的LncRNAs,其中有22个上调的LncRNAs,12个下调LncRNAs。结论:与缺血再灌注损伤组织相比,后适应组织中存在着差异表达LncRNAs,这些显著变化的lncNRAs可能是后适应的生物标记物及改善缺血再灌注组织的潜在治疗靶点。