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目的: 邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)是目前人类使用量最多的增塑剂,而邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(Mono-(2-ethylhexyl) phthalate,MEHP)是其主要毒性代谢产物。至2015年,全球已经产生约3亿吨塑料,其中 79%积聚在垃圾填埋场或自然环境中。由于邻苯二甲酸盐不能与基质共价结合并在工业应用中广泛使用,因此它们可以很容易地浸入水或灰尘中,甚至可以在婴儿配方奶或果冻中被发现。流行病学研究也提示邻苯二甲酸酯代谢产物与胰岛素抵抗和糖尿病之间的关系。实验研究表明,暴露于DEHP的小鼠后代血清中C反应蛋白和肿瘤坏死因子增加并且在脂肪组织和血液成分中的免疫应答和炎症标志物增加。在本研究中大鼠胰岛细胞(INS-1) 被选作研究对象,用来探究MEHP对INS-1细胞的毒性作用,并探讨与此相关的分子机制。 方法: 实验选择INS-1细胞作为研究对象。MTT法用于检测在不同浓度MEHP干预下INS-1细胞存活率;用PI/HOECHST从形态学上检测细胞膜通透性改变;使用LDH检测坏死细胞比例;MEHP以不同的浓度处理INS-1细胞,Western blot检测 INS-1 细胞中焦亡相关蛋白caspase-1、NLRP3、IL-1及ASC和自噬相关蛋白Atg5、ATG7、Atg12、Atg5-12、Beclin1、LC3 及p62 蛋白表达量的变化;以不同的浓度MEHP处理INS-1细胞,Western blot检测INS-1细胞中mTOR、S6K蛋白表达量的变化;用吖啶橙(AO)检测溶酶体膜稳定性;用RT-PCR试验方法检测炎症因子IL-1β 基因的表达水平;透射电子显微镜观察不同浓度 MEHP作用24 h后INS-1细胞自噬小体数量变化;采用免疫荧光观察不同浓度MEHP处理下的INS-1细胞中自噬小体标志蛋白LC3量的改变;采用组织蛋白酶B抑制剂Ca-074-me 干预,检测细胞中caspase-1、ASC 和IL-1β 蛋白表达量的变化,确定NLRP3 的激活是否由组织蛋白酶B介导;用RNA 干扰技术抑制 INS-1 细胞NLRP3基因表达,检测caspase-1和IL-1β蛋白表达量的变化,判断MEHP是否通过NLRP3激活 INS-1 细胞caspase-1的活化;使用Rapa和3-MA干预剂预处理INS-1细胞,检测caspase-1和IL-1β蛋白表达量的变化,确定自噬与焦亡发生是否相关;使用NF-κB抑制剂PDTC,检测caspase-1和IL-1β蛋白表达量,判断NF-κB活化是否参与到MEHP引起胰岛细胞焦亡过程中;用SPSS 19.0对试验结果进行统计学分析。 结果: MEHP处理24小时后的INS-1细胞的细胞活力随着MEHP浓度增加而降低,并且400 μM MEHP诱导INS-1细胞产生焦亡。进一步的试验证明MEHP诱导溶酶体膜渗透性下降由此引起组织蛋白酶B的释放,进而导致NLRP3活化和焦亡发生。此外,MEHP通过改变INS-1细胞中的mTORC1磷酸化水平引起自噬水平改变,在低浓度下胰岛细胞自噬水平逐渐上升而高浓度下自噬水平下降。在高浓度的MEHP处理的INS-1细胞中,组织蛋白酶B也参与到mTORC1的活化过程。抑制mTORC1后INS-1 细胞通过增加自噬水平和降低 NF-κB 活化显著降低IL-1β的基因和蛋白质表达。并且抑制自噬后,MEHP处理的INS-1细胞中的活化的组织蛋白酶B活化增多,caspase-1和IL-1β蛋白表达量的随之增加。 结论: 溶酶体受损是MEHP引起INS-1细胞发生焦亡的主要机制。同时,自噬在MEHP诱导INS-1 细胞焦亡的过程中起着十分重要的作用。mTOR 参与到MEHP引起胰岛细胞的焦亡和自噬水平改变过程中。这些结果表明MEHP以组织蛋白酶B依赖性方式诱导INS-1细胞中的自噬的发生和改变并且引起焦亡发生。