血红素是原卟啉与二价铁的络合物，在生物体中广泛存在，其重要的生理功能已经被人们广为熟知：是机体铁的最大来源；是组成血红蛋白、肌红蛋白的原料，对红细胞的成熟和分化至关重要，是线粒体功能维持不可或缺的物质等等。正常情况下血液中游离血红素水平并不高，大部分是以蛋白结合的形式存在。但在某些特殊的生理或病理条件下，比如出血、红细胞破裂或细胞损伤等，则会释放大量的血红素，造成局部血红素过高。而过多的游离血红素将产生大量的自由基，造成脂质过氧化，一旦进入细胞，对细胞产生严重的毒性作用。为了有效维持稳定的血红素水平，机体细胞通过感受细胞内微小血红素池的变化，控制血红素的合成、分解和转运等途径。近年来，随着血红素转运体的逐步发现，血红素在机体的转运越来越受到人们的关注。2005年Shayeghi等首次证实了十二指肠上皮细胞血红素转运蛋白（HCP1）具有直接摄取血红素并将其转运入细胞内的功能，进入细胞的血红素在加氧酶的作用下分解，其中的铁进入细胞内的铁池被重新利用，血红素转运蛋白的发现明确了由膳食中血红素铁到机体可利用铁的过程。随后的研究，人们也开始关注HCP1在小肠细胞以外细胞的表达及血红素摄取。研究发现，在视网膜色素上皮细胞同样表达HCP1，依赖HCP1摄取的血红素参与色素合成，对维持上述细胞功能稳定意义重大。此外，大量的研究表明，脑铁代谢紊乱与众多神经退行性疾病的发生发展密切相关。在培养的大鼠原代星形胶质细胞，血红素同样能够通过HCP1进入细胞，在短时间内即可看到细胞内出现大量的铁颗粒聚集。研究还指出，在出血性脑卒中情况下，红细胞破坏释放大量血红素，此时细胞通过HCP1途径快速摄取血红素将会加剧该病的恶化，并增加死亡率。可见，HCP1的重要功能不仅仅是小肠细胞的血红素转运体，介导肠道膳食血红素铁的吸收；同时也对机体其它细胞乃至组织器官功能稳定的维持具有积极的作用。肝脏，作为铁代谢和铁储存最重要的器官，血红素在肝脏的合成、分解和转运研究历来受到人们的重视。然而，血红素在肝脏的转运以及肝细胞摄取血红素的具体途径和调控机制却一直未有明确阐明。早期的研究提出，血红素具有亲脂特性，可通过扩散作用跨过细胞膜进入肝细胞；也有研究指出，血红素是与血液结合素形成复合物，通过细胞膜内陷吞噬作用进入肝细胞；但近年来的研究大多认为肝细胞对血红素的摄取是一个依赖能量的过程，并且是需要转运体协助，受特定机制调控的途径。因此，血红素转运蛋白（HCP1）的途径可能是最支持上述观点的。对HCP1的表达研究已经证实，HCP1在肝脏以及肝癌细胞上均有明显表达。但是肝细胞是否同样能够通过HCP1摄取血红素，以及其摄取血红素的影响因素和调控机制却并不清楚。本课题拟通过细胞实验，用含血红素的培养液培养肝细胞，通过原子吸收法、普鲁士蓝染色法、以及将肝细胞HCP1基因进行特异性干扰和过表达等方法，观察肝细胞HCP1血红素的摄取功能，明确肝细胞是否可以通过HCP1摄取血红素；并通过细胞实验和动物实验探讨肝细胞HCP1血红素摄取的影响因素以及HCP1表达变化的可能分子机制。研究目的通过观察肝细胞对血红素的摄取变化，明确肝细胞是否可以通过HCP1摄取血红素，并探讨肝细胞HCP1摄取血红素的影响因素以及HCP1表达变化的可能分子机制。研究结果将有助于进一步认识肝脏铁的吸收机制，丰富肝铁代谢理论知识；同时也为铁缺乏、铁负荷等铁代谢异常患者的预防和治疗提供新的思路和潜在治疗靶点。研究方法一、肝细胞HCP1摄取血红素功能的观察1．肝细胞HCP1表达量测定和细胞株选择PCR检测人肝细胞（HL7702, L02细胞）和肝癌细胞（HepG2细胞）的表达量，产物经DNA电泳鉴定。2．含血红素培养液培养肝细胞，检测细胞活性和细胞内铁含量不同浓度不同时间血红素培养肝细胞，采用CCK8试剂盒检测血红素对肝细胞活性的影响；用原子吸收法测量细胞内的铁含量；用普鲁士蓝染色法检测细胞内铁颗粒的聚集状况，3.干扰肝细胞HCP1基因表达，检测细胞对血红素的摄取变化设计并合成HCP1干扰RNA（HCP1siRNA）,转染L02细胞，采用实时荧光定量PCR法检测干扰效果；成功干扰后再加血红素培养细胞（同2培养），原子吸收法测定肝细胞内铁含量。4.过表达肝细胞HCP1基因，检测细胞对血红素的摄取变化设计并构建HCP1过表达质粒（pHCP1），转染人肝细胞L02细胞，Real Time PCR法检测过表达效果；肝细胞HCP1成功过表达后再加血红素培养（同2），原子吸收法测定细胞内铁含量。5.肝细胞用含锌卟啉的培养液培养，观察细胞内荧光变化用锌卟啉（血红素类似物，激发后发红色荧光）培养肝细胞，荧光显微镜下观察肝细胞HCP1是否能摄取锌卟啉。肝细胞HCP1基因干扰和过表达后，再加锌卟啉培养，观察此时细胞内的荧光变化。二、肝细胞HCP1血红素摄取的影响因素探讨1.铁含量对肝细胞和肝脏HCP1表达的影响由于多数的铁代谢相关蛋白表达都受到细胞内铁含量的调控，所以首先检测了铁含量对肝细胞HCP1的表达是否有影响。通过检测不同铁含量培养的肝细胞以及不同铁负荷下的小鼠肝脏HCP1表达情况，推测肝细胞内铁储存状态对HCP1血红素摄取的影响。（1）高铁和缺铁环境培养对肝细胞HCP1表达的影响细胞分组如下处理，缺铁组（加去铁胺DFO培养），高铁组（加离子铁、血红素铁培养），对照组（L02细胞正常培养）。实时荧光定量PCR和western blot法检测细胞内铁含量对HCP1mRNA和蛋白表达水平的影响。（2）不同铁营养状况小鼠肝脏HCP1的表达建立不同铁营养状况的小鼠模型，缺铁组（喂饲缺铁饲料），高铁组（喂饲缺铁饲料+注射右旋糖酐铁总量12mg），对照组（喂饲缺铁饲料+注射右旋糖酐铁总量1.2mg），造模2周。2周后处死小鼠，眼球取血，生化仪器检测血清铁代谢相关参数变化；取肝脏，原子吸收法检测肝脏铁含量，实时荧光定量PCR和western blot法检测不同铁营养状况小鼠肝脏HCP1表达变化。2.糖皮质激素对肝细胞HCP1表达和血红素摄取的影响课题组前期通过基因芯片研究发现，心理应激中皮质酮明显升高的大鼠，其肝脏HCP1表达亦升高，而已有的文献也表明糖皮质激素可以诱导巨噬细胞HCP1表达增强，因而观察糖皮质激素是否能影响肝细胞HCP1的表达和对血红素的摄取。（1）肝细胞用不同浓度皮质醇预先处理24h，检测皮质醇对HCP1表达的影响；（2）肝细胞用含皮质醇的培养液预先培养24h，再加入血红素培养，原子吸收法测定细胞内铁含量，观察肝细胞HCP1摄取血红素是否受皮质醇影响。3．叶酸对肝细胞HCP1血红素摄取的影响已有的文献证实，HCP1不仅是血红素的转运体，同时也是叶酸的转运体（proton-coupled folate transporter，PCFT）。观察叶酸是否对肝细胞HCP1转运血红素具有竞争性抑制作用。L02细胞添加叶酸培养，预先干预1h，再加血红素培养2h，原子吸收法检测细胞内铁含量，推测叶酸对肝细胞HCP1血红素摄取是否具有抑制作用。三、铁含量对肝细胞HCP1表达影响的分子机制探讨在实验二中我们观察到不同铁含量培养的肝细胞以及不同铁负荷的小鼠肝脏HCP1表达发生明显改变。因此，本部分的实验目的主要是探讨铁含量影响肝细胞HCP1表达的分子机制。1.筛选可能的转录因子已有的研究表明，HCP1/PCFT基因受转录因子KLF4、HNF4α、NRF1、YY1等调控，为了证实铁含量对HCP1表达的影响是否通过上述转录因子实现，采用离体细胞实验，通过给予不同的铁含量培养，检测KLF4、HNF4α、NRF1、YY1等转录因子的表达变化。2.验证铁含量对转录因子HNF4α表达的影响通过前一步实验，筛选到转录因子HNF4α。采用Western blot法检测不同铁含量培养的肝细胞HNF4α蛋白表达变化；采用荧光定量PCR和Western blot法检测不同铁营养状况小鼠肝脏HNF4α mRNA和蛋白表达变化。3.特异性干扰肝细胞HNF4α表达，检测铁含量对HCP1表达的影响设计并合成人HNF4α siRNA，转染细胞，PCR方法检测干扰效果。成功干扰HNF4α表达后，再加去铁胺DFO，检测HCP1表达变化。4.铁含量对肝细胞HNF4α与HCP1结合活性的影响肝细胞采用同上方法建立缺铁（加DFO）和高铁（加Holo-transferrin）模型，对照组为正常培养的细胞，采用染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测在不同铁含量培养下肝细胞转录因子HNF4α与HCP1的结合活性变化，进一步证实HNF4α在铁调节HCP1表达过程中的重要作用，从而初步阐明肝细胞HCP1表达受铁含量调控的分子机制。四、数据的统计与分析实验数据用(X±S)表示，使用统计软件SPSS16.0进行数据统计分析，采用两样本t检验和单因素方差分析（one-wayANVOA）进行各组之间的比较。结果以p<0.05为显著性水平，p<0.01为非常显著性水平。结果一、肝细胞HCP1摄取血红素功能的观察1．肝细胞HCP1表达量测定和细胞株选择人肝细胞（L02细胞）和肝癌细胞（HepG2细胞）都明显表达HCP1，考虑到L02细胞更接近于人正常生理状态下的肝细胞，因而主要选择了L02细胞进行后续实验。2．不同浓度不同时间血红素培养肝细胞，检测细胞活性和细胞内铁含量（1）用浓度为30μM和50μM的血红素培养肝细胞6小时，用CCK8试剂盒检测血红素对细胞活性的影响，发现30μM血红素对细胞活性无明显影响，而50μM血红素培养的肝细胞活性明显下降。因而，后续的实验都采用不超过30μM浓度的血红素培养。（2）不同浓度不同时间血红素培养的肝细胞，细胞内铁含量随着血红素培养浓度以及时间的增加而增加。（3）用血红素培养肝细胞12h后，普鲁士蓝染色发现细胞内出现明显的铁颗粒聚集现象。3.干扰肝细胞HCP1基因，检测细胞对血红素的摄取变化用HCP1siRNA转染L02细胞，荧光定量PCR法检测HCP1表达显著下调，表明肝细胞HCP1基因成功干扰；此时用原子吸收法检测到细胞对血红素的摄取也明显下降。4.过表达肝细胞HCP1基因，检测细胞对血红素的摄取变化HCP1过表达质粒成功转染L02细胞，Real Time PCR法显示肝细胞HCP1表达显著上升，表明过表达成功；此时肝细胞对血红素的摄取也明显上升。5.肝细胞用含锌卟啉的培养液培养，观察细胞对锌卟啉的摄取用含锌卟啉的培养液培养肝细胞6小时，荧光显微镜下观察到肝细胞膜及细胞内都有非常明显的红色荧光。肝细胞HCP1基因干扰后，用含锌卟啉的培养液培养，此时细胞内荧光明显减少；肝细胞HCP1基因过表达后，用含锌卟啉的培养液培养，荧光显微镜下观察到此时细胞内荧光明显增多。二、肝细胞HCP1血红素摄取的影响因素探讨1.铁含量对肝细胞和肝脏HCP1表达的影响1.1高铁和缺铁环境培养对肝细胞HCP1表达的影响（1）肝细胞加血红素培养，细胞内的铁含量增加，此时肝细胞HCP1表达明显下调；（2）肝细胞高铁环境（加holo transferrin）培养24h，TFR1mRNA表达明显降低，表明此时细胞内铁浓度高，而此时HCP1mRNA表达也明显下降；（3）肝细胞缺铁环境（加DFO，去铁胺）和高铁环境（holo transferrin）培养24h，细胞HCP1蛋白水平在缺铁时表达上升，而在高铁时则表达下降。1.2不同铁营养状况小鼠肝脏HCP1的表达变化（1）参照文献，建立不同铁负荷小鼠模型，造模两周。各组之间小鼠体重无差异；铁代谢相关指标：血清铁、总铁结合力、转铁饱和度以及肝铁含量等各组之间均存在明显差异。（2）实时荧光定量PCR和western blot法检测不同铁营养状况小鼠肝脏HCP1表达发现，缺铁小鼠肝脏HCP1表达明显上升，而高铁小鼠HCP1表达则明显下降。2.糖皮质激素对肝细胞HCP1表达和血红素摄取的影响（1）定量PCR和Western blot法结果显示，不同浓度的皮质醇对肝细胞HCP1表达几乎无影响。（2）不同浓度皮质醇干预的细胞再加血红素培养，原子吸收法检测细胞内铁含量，发现皮质醇对肝细胞HCP1转运血红素几乎无影响。3．叶酸对肝细胞HCP1血红素摄取的影响本实验用原子吸收法检测细胞内的铁含量发现，用叶酸预先处理过再加血红素培养的细胞与直接加血红素培养的细胞，两组铁含量无明显差别；推测叶酸对肝细胞HCP1摄取血红素可能无影响。三、铁含量对肝细胞HCP1表达影响的分子机制探讨1.筛选可能的转录因子荧光定量PCR法检测了不同铁含量培养的L02细胞KLF4、HNF4α、NRF1、YY1等转录因子的表达变化，发现只有转录因子HNF4α表达随着铁含量改变而改变，且差异有统计学意义，而其它几个转录因子的表达均无明显差异。2.验证铁含量对转录因子HNF4α表达的影响Western blot结果显示HNF4α的表达在缺铁时表达上升，在高铁时表达下降，与前期HCP1表达变化一致。定量PCR和Western blot结果显示，缺铁组小鼠肝脏HNF4α mRNA和蛋白表达水平与对照组比均上升，而高铁组小鼠肝脏HNF4α mRNA和蛋白表达水平与对照组比均下降，与细胞实验结果和前期HCP1表达变化一致。3.特异性干扰肝细胞HNF4α，检测铁含量对HCP1表达的影响PCR结果显示，转染了HNF4α siRNA的肝细胞，HNF4α mRNA和蛋白表达显著下降，表明基因干扰成功。此时，细胞再加DFO和Holo-transferrin处理，则细胞HCP1表达水平与对照组比无明显差异。4.铁含量对肝细胞HNF4α与HCP1结合活性的影响染色质免疫共沉淀法（ChIP）结果显示HNF4α在缺铁时与HCP1结合活性增强，而在高铁时HNF4α与HCP1结合活性则减弱。结论1.采用离体细胞实验，通过原子吸收、普鲁士蓝染色、基因干扰、过表达等实验方法，初步证实肝细胞可以通过HCP1摄取血红素。2.肝细胞HCP1摄取血红素受细胞内铁储存状态的影响，但可能不受皮质醇和叶酸的影响。3.铁含量对肝细胞HCP1表达的影响可能是通过转录因子HNF4α实现。