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目的:自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)是常见的器官特异性自身免疫病,是临床甲减的主要病因,以血清中存在甲状腺自身抗体、甲状腺组织中淋巴细胞浸润和滤泡结构破坏为主要临床特征。遗传和环境因素共同参与AIT发病,然而具体机制尚不明确。甲状腺本身或免疫系统的异常改变都可能导致免疫耐受打破,进而启动自身免疫反应。近年来,固有免疫系统被认为是连接遗传易感性与环境性危险因素的交汇点,固有免疫反应的结局决定是否进一步发展为适应性免疫反应为主导的自身免疫损伤过程。以Toll样受体为代表的模式识别受体在多种自身免疫病发病机制中的研究为AIT免疫病因学提供了新的研究思路。炎症小体是由胞浆内模式识别受体NOD样受体家族或黑素瘤缺乏因子2受体家族的部分成员(NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2)、凋亡相关点状蛋白(ASC)、前半胱天冬酶-1(Pro caspase-1)组成的高分子蛋白复合体,可通过介导白介素-18(Interleukin18,IL-18)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等细胞因子翻译后修饰活化和程序性细胞死亡(细胞焦亡、凋亡)发挥促炎症作用。IL-18又称为干扰素-γ诱导因子,以Pro IL-18前肽(24KDa)形式合成并储存在细胞内,经Caspase-1剪切为具有生物学活性的Active IL-18(18KDa)并释放到细胞外,可显著促进1型CD4~+辅助T细胞反应。细胞焦亡是由Gasdermin D介导的一种炎症型细胞死亡形式,可诱导发生免疫反应,以细胞膜完整性破坏、细胞内容物释放为主要特征。近年来,炎症小体被报道参与系统性红斑狼疮、多发硬化、1型糖尿病等多种自身免疫病的发生发展,然而其在AIT发病中的作用及机制仍不得而知。因此,本研究旨在探讨经典炎症小体蛋白组分NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、ASC、Caspase-1及其下游细胞因子IL-1β和IL-18在AIT患者甲状腺组织及外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的表达及翻译后修饰改变,并进一步在培养的甲状腺细胞系中探讨炎症小体激活对活性细胞因子释放和细胞焦亡的影响。方法:第一部分:收集AIT甲状腺组织50例及年龄、性别匹配的对照甲状腺组织50例,另收集50例AIT患者及50例匹配健康对照者的外周全血及血清,密度梯度离心法分离PBMC。电化学免疫发光法测定血清游离T3,游离T4,促甲状腺激素,甲状腺球蛋白抗体及甲状腺过氧化物酶抗体。提取甲状腺组织及PBMC总RNA、总蛋白,real-time PCR检测炎症小体相关指标NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、ASC、Caspase-1及下游细胞因子IL-1β、IL-18的mRNA表达水平,Western-Blot检测上述指标蛋白表达水平。其中,Caspase-1、IL-18、IL-1β活性剪切蛋白分子(即Caspase-1p20、Active IL-18、Active IL-1β)用Western-Blot方法检测。免疫组织化学染色法定位NLRP1、NLRP3、NLRC4及AIM2在甲状腺组织中的表达分布。酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清IL-18、IL-1β水平。第二部分:培养人甲状腺上皮细胞系(Nthy-ori 3-1),梯度浓度TNF-α(0、125、250、500IU/ml)、IFN-γ(0、250、500、1000 IU/ml)、IL-17A(0、0.01、0.1、1 ng/ml)、IL-6(0、0.01、0.1、1 ng/ml)刺激细胞24h后,real-time PCR检测NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达变化,Western-Blot检测炎症小体组分蛋白表达变化,ELISA测定细胞上清IL-18、IL-1β浓度。用250IU/ml IFN-γ、1μg/ml poly(d A:dT)分别或共同刺激甲状腺细胞后,免疫荧光检测ASC光斑,ELISA测定细胞上清IL-18水平,Western-Blot检测细胞Caspase-1 p20、Active IL-18、Gasdermin D-N端肽段表达水平,FITC-Annexin V/PI染色、流式细胞技术评估细胞死亡,吸光光度法测定细胞上清乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平。用Caspase-1抑制剂z-YVAD-FMK预处理、IFN-γ及poly(dA:dT)共刺激甲状腺细胞,ELISA测定细胞上清IL-18水平,吸光光度法测定细胞上清LDH水平。结果:第一部分:AIT组甲状腺组织中炎症小体相关指标NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01)。AIT组甲状腺组织中炎症小体相关细胞因子IL-18、IL-1βmRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01)。与对照组相比,AIT组甲状腺组织中Caspase-1及IL-18、IL-1β翻译后修饰增加,提示炎症小体活性增强。石蜡切片免疫组化染色显示NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2主要在AIT甲状腺组织中淋巴细胞浸润区周围的甲状腺滤泡细胞着色。AIT组甲状腺组织中NLRP1、ASC mRNA表达水平与血清自身抗体呈显著正相关。AIT组PBMC中炎症小体相关指标NLRP3、NLRC4 m RNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01),而两组NLRP1、AIM2、ASC、Caspase-1mRNA及蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。AIT患者PBMC中Caspase-1及IL-18翻译后修饰增加,血清IL-18水平较对照组升高(P<0.05);而两组PBMC中Active IL-1β蛋白表达水平及血清IL-1β水平无显著差异(P>0.05)。第二部分:体外培养的甲状腺细胞表达低水平的NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、Caspase-1蛋白分子。250U/ml IFN-γ即可显著升高NLRP3、AIM2、ASC、Caspase-1、IL-18 mRNA表达水平(P<0.05),而使IL-1βm RNA表达水平略降低。梯度浓度(0、125、250、500 IU/ml)TNF-α处理甲状腺细胞24 h后,NLRP3、Caspase-1、IL-18 mRNA表达水平呈浓度依赖性升高(P<0.05)。TNF-α使甲状腺细胞NLRP1、AIM2 mRNA表达增加(P<0.05),但无浓度依赖性。而IL-17A、IL-6对炎症小体各指标mRNA表达水平均无影响(P>0.05)。TNF-α、IFN-γ单独刺激或共刺激甲状腺细胞均不改变细胞上清中IL-18、IL-1β水平(P>0.05)。250IU/ml IFN-γ预处理甲状腺细胞24 h后,poly(dA:dT)刺激12 h可见ASC蛋白在细胞核周围聚集并与AIM2共定位,提示AIM2炎症小体形成。与对照组相比,poly(d A:dT)+IFN-γ共刺激后,细胞上清IL-18水平显著升高,Annexin V(+)/PI(+)细胞比率增加,细胞上清LDH浓度升高,细胞内Gasdermin D-N端肽表达增加,提示细胞焦亡增多。抑制Caspase-1活性可显著降低poly(dA:dT)+IFN-γ共刺激诱导的细胞上清IL-18及LDH水平。结论:与对照组相比,AIT患者甲状腺组织NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2炎症小体表达增加,PBMC中NLRP3、NLRC4炎症小体表达增加。炎症小体可能通过Caspase-1介导IL-18、IL-1β等细胞因子翻译后修饰活化和甲状腺细胞焦亡两个主要途径促进AIT自身免疫发病机制。AIT甲状腺组织中存在的炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α促进甲状腺细胞内炎症小体的表达和激活。因此,本研究揭示了NLRP1/NLRP3/NLRC4/AIM2—Caspase-1—IL-18/IL-1β轴和细胞焦亡在AIT发病机制中启动炎症反应并使炎症反应级联扩大的作用。