【摘 要】
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本研究首先通过分子克隆、大肠杆菌表达和蛋白纯化获得了BPSA蛋白,对BPSA蛋白进行动力学表征显示,测定其Km值和Kcat值。然后利用BPSA蛋白催化谷氨酰胺合成蓝色化合物indigoid
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本研究首先通过分子克隆、大肠杆菌表达和蛋白纯化获得了BPSA蛋白,对BPSA蛋白进行动力学表征显示,测定其Km值和Kcat值。然后利用BPSA蛋白催化谷氨酰胺合成蓝色化合物indigoidine的特性构建了 L-谷氨酰胺高通量检测方法。以此为基础,成功构建了谷氨酰胺高产菌株的高通量筛选方法,为今后高产菌株的筛选和工业化生产提供理论基础。研究结果如下:动力学实验完成了BPSA蛋白的表征,其Km值为0.79±0.667mM,Kcat值为5.658mM。当发酵液中L-谷氨酰胺浓度在0.2mM至5mM时,可以通过该方法准确检测到L-谷氨酰胺的含量。本课题通过克隆及在谷氨酸棒杆菌中共表达bpsA和sfp基因,首次实现了在谷氨酸棒杆菌中生产新型靛蓝染料indigoidine。通过对L-谷氨酰胺的添加量(0、0.73、4.38、11.68)g/L、IPTG 添加量(0.1、0.2、0.4、0.8、1.5、2)mM、诱导时间(48、72)小时及诱导温度(18℃、25℃、30℃)的条件优化,最终确定,当L-谷氨酰胺添加为11.68g/L,IPTG浓度为0.8mM,18℃诱导48小时后indigoidine产量最高可达到 1.75g/L。
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