杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我国珍稀二级保护植物,分布于热带至暖温带地区,是多年生落叶乔木,单科单属单种。杜仲是中国特有的优良经济林树种,不仅是中国传统名贵的中药材,也是一种具有开发潜能的产胶植物,在它的果皮、树皮和叶片中均含有白色杜仲胶,又称古塔波胶。但杜仲胶生物合成机理至今尚未完全清楚,已发现橡胶链的延伸与橡胶延长因子（REF）和小橡胶颗粒蛋白（SRPP）有关,二者具有相同的保守结构域,因结构域外N端和C端长短不同而区分,REF有可变长N端,SRPP有可变长C端。本研究以种植在贵州大学实验基地（贵阳花溪）生长18年杜仲成年植株为材料,以构建的杜仲全基因组为基础,克隆了Eu REF8、EuSRPP2和EuSRPP3,对其表达模式进行研究,并重点研究EuSRPP1基因的作用机制,取得如下研究结果:1.杜仲发育过程中橡胶的积累规律杜仲花期结束后,从4月至11月,每月分别取杜仲雌雄株叶片、茎皮和雌株果皮,分别测定各组织含胶量。结果表明:雌雄株叶片、茎皮和雌株果皮的含胶量均随组织器官的发育而增多,在4月含量最低,6至9月是橡胶积累的快速时期,9月后橡胶积累逐步趋于稳定,11月最高。雌株叶片含胶量从0.51%至2.23%,茎皮从0.76%至12.38%,果皮从2.93%至14.67%;雄株叶片从0.33%至2.57%,茎皮从0.74%至11.05%。5月雌株叶片含胶量高于雄株,6、7、8、10和11月雄株叶片含胶量高于雌株,差异均达到显著水平（P＜0.05）。10、11月雌株茎皮含胶量高于雄株,差异达到极显著水平（P＜0.01）。从4月至11月,杜仲各器官含胶量为果皮＞茎皮＞叶片,差异均达到极显著水平（P＜0.01）。由此说明,随着杜仲生长发育,雄株叶片含胶量逐渐高于雌株叶片,而雌株茎皮含胶量逐渐高于雄株茎皮。2.杜仲发育过程中橡胶分子量变化规律分析不同时期各个组织器官中杜仲胶的平均分子量（Mw）。结果表明:在4月至9月期间,不同器官橡胶Mw均随时间的延长而上升,但增加量有差异,9月至11月差异不显著。4月时最低,雌、雄株叶片Mw分别为3.59×10~6 Da和7.38×10~6 Da,雌、雄株茎皮Mw分别为2.51×10~6 Da和0.84×10~6Da,果皮为2.53×10~6 Da。9月时各器官橡胶Mw达到最大值,雌、雄株叶片分别为12.43×10~6 Da和16.57×10~6 Da,雌、雄株茎皮Mw分别为5.29×10~6 Da和6.23×10~6 Da,果皮为8.31×10~6 Da。4月至11月,叶片中橡胶Mw均为雄株＞雌株,茎皮橡胶Mw在4月和5月时为雌株＞雄株,6月至11月为雄株＞雌株,差异均达到显著水平（P＜0.05）。此期间Mw均为叶片＞果皮＞茎皮。说明叶片中含胶量虽然最少,但是橡胶的Mw却是最大。4月至11月期间,在杜仲雌、雄株不同器官中,各分子量分布随着器官生长发育呈现不同趋势。小分子量（小于100×10~4Da）橡胶分布呈现先下降后上升的趋势,4月时分布最多,雌、雄株叶片分别为为27.86%和17.08%,茎皮分别为44.61%和75.15%,果皮为38.86%;雄株叶片在7月最少,为2.44%,雌株叶片在8月最少,为2.60%,雌株茎皮在9月最少,为9.62%,雄株茎皮在8月最少,为9.65%,果皮在7月最少,为2.57%。大分子量橡胶（1300×10~4）分布呈现先上升后下降的趋势,4月最少,雌、雄株叶片分别为3.60%和17.10%,茎皮分别为1.97%和0.93%,果皮为4.76%;9月最多,雌、雄株叶片分别为39.79%和33.06%,雌、雄株茎皮分别为20.14%和20.39%,果皮为20.13%。说明4月至8月期间各器官组织中橡胶分子量随着器官生长而增大,8月至9月期间长链聚异戊二烯不增加或增加较短链聚异戊二烯缓慢。3.橡胶Eu REF/SRPPs基因的克隆与表达分析以本项目组从前期构建的杜仲转录组及基因组数据库,筛选出12个杜仲REF/SRPPs基因片段,克隆获得3个具有完整c DNA的杜仲REF/SRPPs基因,序列长度分别为267 bp、630 bp和651bp,经保守区及N末端、C末端分析,分别命名为Eu REF8、EuSRPP2和EuSRPP3。系统进化树分析表明,Eu REF8、EuSRPP2、EuSRPP3与巴西橡胶树和橡胶草的REF/SRPP亲缘关系较接近。本实验室前期已获得EuSRPP1,序列长度为678 bp,共编码225个氨基酸。采用q RT-PCR对杜仲各组织各时期中EuSRPP1、Eu REF8、EuSRPP2和EuSRPP3的相对表达量进行分析,并分析表达量与同时期杜仲组织器官中的橡胶分子量大小和含胶量的相关性。结果表明:4月至11月期间,EuSRPP1、Eu REF8、EuSRPP2和EuSRPP3在雌、雄株不同时期的叶片和茎皮中均有表达,且呈先上升后下降的趋势。叶片中EuSRPP1的表达量均在9月达到最大值;Eu REF8和EuSRPP2的表达量均在7月达到最大值;EuSRPP3的表达量在5月达到最大值。茎皮中EuSRPP1的表达量在9月达到最大值;Eu REF8和EuSRPP2的表达量均在7月达到最大值;EuSRPP3的表达量在9月时达到最大值。果皮中EuSRPP1表达量呈下降趋势,4月为最高。Eu REF8在果皮中的表达呈现先上升后下降的趋势,5月最高;EuSRPP2和EuSRPP3在果皮中的表达均呈现先下降后回升的趋势,9月最低。在4至9月期间,EuSRPP1表达特征在叶和茎皮中与含胶量增长规律和分子量变化规律呈正相关关系（P＜0.05）。雌、雄株茎皮中Eu REF8表达特征与橡胶分子量变化规律呈显著正相关（P＜0.05）。雌、雄株茎皮中EuSRPP3基因表达特征与胶含量增长规律呈显著正相关（P＜0.01）,雌株中EuSRPP3基因表达特征与橡胶分子量变化规律呈正相关（P＜0.05）。EuSRPP1的表达特征与含胶量增长规律和分子量变化规律相关性最高,说明EuSRPP1在杜仲胶合成中发挥重要作用。4.EuSRPP1定位及基因表达对含胶量和橡胶分子量的影响构建原核表达载体p ET-28a-EuSRPP1,制备EuSRPP1单克隆抗体,以10nm的金颗粒作为标记物,对杜仲韧皮部含胶细胞中EuSRPP1蛋白进行定位,结果显示该蛋白定位于橡胶颗粒表面。说明EuSRPP1存在橡胶颗粒上发挥作用。以Actin1为启动子构建EuSRPP1基因的超量表达载体p GM626-Act1-EuSRPP1和RNAi干扰植物表达载体p GM626-Act1-EuSRPP1-RNAi,经验证分别获得EuSRPP1和EuSRPP1-RNAi转基因杜仲。对两种抗性苗EuSRPP1进行表达特征分析,和野生型相比,在OE植株中,EuSRPP1的表达量是WT的2.53和3.68倍,杜仲胶合成相关基因Eu IPI、Eu FPS和Eu GGPPS均显著高于WT。在RNAi干扰植株中,EuSRPP1的表达量仅是野生型的3.92%和42.38%,Eu IPI、Eu FPS和Eu GGPPS同样显著低于WT。说明杜仲中EuSRPP1的表达能反馈调节上游胶合成前体相关基因的表达。对两种转基因愈伤中胶含量进行测定,结果表明:在OE愈伤组织中含胶量显著高于WT,RNAi干涉的愈伤组织中含胶量显著低于WT。橡胶分子量分析表明,在WT愈伤组织中橡胶Mw为1.29×10~6Da,在OE愈伤组织中Mw为2.31×10~6Da,而RNAi干涉的愈伤组织中Mw为0.36×10~6Da。对三种愈伤组织中橡胶分子量分布分析表明,RNAi干涉的愈伤中,没有分子量大于300×10~4 Da的橡胶,分子量大于500×10~4 Da的分布为OE愈伤＞WT愈伤。说明EuSRPP1表达能够增加胶含量和橡胶分子量。利用透射电镜对转基因和WT杜仲叶脉韧皮部含胶细胞中的橡胶颗粒进行观察,在OE植株中,橡胶颗粒电子密度比WT更深。RNAi干扰的植株中,橡胶颗粒的直径小于WT植株中的橡胶颗粒。说明EuSRPP1可能参与促进橡胶的生物合成。5.GA对胶含量和分子量的影响提取300mg/m L GA3处理的杜仲幼苗的橡胶,进行胶含量和分子量测定,结果表明,处理组中胶含量为1.40%,对照组为0.72%,处理组中橡胶Mw为2.72×10~6Da,对照组中为2.04×10~6Da,差异均达到极显著水平（P＜0.01）。处理组中,橡胶Mw小于1×10~4 Da的分布为对照组大于GA3处理组,橡胶Mw大于300×10~4 Da的分布为对照组小于处理组,说明GA3处理后能促进橡胶合成增多和分子量增大。GA3处理杜仲幼苗后,EuSRPP1、EuSRPP2和EuSRPP3的表达量均高于对照组,分别是对照组的1.34倍,1.27倍和2.12倍,仅Eu REF8的表达量下降,是对照组的65%。说明GA3能够调控Eu REF/SRPPs的表达并引起含胶量和分子量的变化。