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目的:听力损失作为危害人类健康的重大感觉障碍疾病,一直是世界性的公共卫生问题。值得关注的是约60%以上的听力损失是由遗传因素导致,多数为单基因遗传。X-连锁遗传性耳聋较常染色体遗传性耳聋相对罕见,在遗传性耳聋中的发病比例约占1%左右。本研究旨在鉴定一个X-连锁显性遗传非综合征型耳聋家系的致病突变,同时在斑马鱼中检测smpx基因的表达谱,构建smpx基因敲除和敲低模型,探讨可疑致病基因SMPX的致聋机制。方法:第一部分:耳聋家系致病基因的突变分析收集家系临床资料,采用全外显子测序、生物信息分析对家系中2名患者及1名表型正常者进行测序分析,经数据比对及突变筛选后获得候选突变。采用PCR-Sanger测序法对家庭成员进行突变检测,验证该突变与表型的相关度。使用Homolo Gene对突变进行多物种间保守性分析。应用X染色体失活检测探讨表型异质性原因。第二部分:斑马鱼smpx基因的克隆和表达分析应用生物信息学进行多物种间SMPX氨基酸序列的比对。在斑马鱼中,应用整体胚胎原位杂交在m RNA水平检测smpx的时空表达,采用免疫荧光染色在蛋白质水平检测其亚细胞定位。第三部分:smpx基因敲除、敲低斑马鱼模型的建立及表型分析设计合成g RNA,采用CRISPR/Cas9系统构建smpx基因敲除模型,剪尾测序及Western Blot验证突变体基因型及蛋白表达。与此同时,设计合成smpx基因Morpholino,体外验证smpx-MO的有效性,采用胚胎显微注射技术建立smpx基因敲低模型。观察smpx基因敲除、敲低对斑马鱼内耳、毛细胞、静纤毛发育及行为学的影响。体外合成SMPX m RNA及SMPX m RNA（p.Q88E）,并与smpx-MO共注射,观察侧线神经丘毛细胞表型挽救情况,验证SMPX c.262C＞G突变位点的致病性。第四部分:smpx基因的致聋机制研究采用转录组学分析,筛选及验证差异表达基因,并对显著差异基因进行GO、KEGG以及GSEA富集分析,同时应用实时定量荧光PCR和TUNEL验证转录组数据,为明确smpx基因的致聋机制奠定基础。结果:第一部分:耳聋家系致病基因的突变分析1、临床资料显示,该家系中所有受累家庭成员均表现为双耳对称性感音神经性听力损失,且高频听力损失较低频听力损失严重,但男女听力损失程度和发病年龄有较大差异。2、全外显子测序及突变分析结果表明,该家系的致病基因为已知耳聋基因SMPX的新错义突变（SMPX c.262C＞G:p.Gln88Glu）。该突变位点在哺乳动物中高度保守。Sanger测序证实该突变在家系中与表型共分离。3、X染色体失活分析显示先证者的X失活比为29:71,即存在轻度遗传偏移。第二部分:斑马鱼smpx基因的克隆和表达分析1、生物信息学分析结果显示,SMPX氨基酸序列在脊椎动物进化中高度保守。2、整体胚胎原位杂交结果显示smpx在斑马鱼胚胎发育过程中普遍表达,在斑马鱼内耳、眼周肌组织、后脑及神经管中高表达。3、免疫染色示smpx特异性表达于耳石膜及角质板,可能促进耳石融合,并参与纤毛结构的维持与稳定。第三部分:smpx基因敲除、敲低斑马鱼模型的建立及表型分析1、采用CRISPR/Cas9技术最终获得了smpx基因的两种稳定突变体,即smpxzm2/+（4bp del）和smpxzm3/+（8bp del,19bp ins）。经过测序鉴定及Western blot验证,突变体构建成功。2、采用Morpholino及显微注射技术获得smpx基因敲低模型（smpx-MO）。经体外验证,斑马鱼smpx基因敲低模型构建成功,可用于后续表型研究。3、smpx敲除、敲低均不影响斑马鱼整体发育,但在一定程度上干扰内耳发育,其中smpxzm3/-表现为2dpf椭圆囊减小,球囊呈非椭圆以及耳石数量的改变;smpxzm2/-及smpx-MO则表型为耳囊面积轻度减小。smpx敲除、敲低均导致后部侧线系统及前部侧线系统中神经丘数量的减少,前部侧线系统更为显著;同一部位后侧线神经丘中,毛细胞数量减少。smpx敲除、敲低均在一定程度上干扰内耳毛细胞静纤毛发育,导致静纤毛呈不同程度数量及长度减少。smpx敲除、敲低可导致斑马鱼对声音刺激的应答减弱、活动度降低。4、挽救实验显示过表达SMPX m RNA（p.Q88E）与smpx-MO突变体相比,毛细胞簇及其单簇毛细胞数目部分挽救,但与过表达SMPX m RNA相比较弱。第四部分:smpx基因的致聋机制研究1、转测组分析共筛选出1438个差异表达基因,包括845个上调基因和593个下调基因。显著上调基因包括:fosab、erbb3b、hsp70l、hsp70.3、hspb1、hsp70.1、hsp70.2、il1b、tcap、nupr1b、sdhc等;显著下调基因包括:eef2a.1、tspan36、pdap1a、stk3、grinab、sh3glb1a、aco2、tars1、cep131、rdh10a、dcaf11等。2、TOP30显著上调的差异基因中fosab、erbb3b、hsp70l、hsp70.3、hspb1、hsp70.1、hsp70.2、il1b均涉及MAPK信号通路。3、经q PCR验证,促炎相关基因Il1b,热休克蛋白家族基因hsp70l、hsp70.3、hspb1、表皮生长因子基因erbb3b等均在smpx基因敲除突变体模型中高表达。4、smpx基因表达缺失可能通过p38 MAKP信号通路介导毛细胞凋亡。结论:1、经鉴定该家系的致病突变为SMPX基因的新错义突变（SMPX c.262C＞G:p.Gln88Glu）,该突变经挽救实验证实为致病性突变位点。2、X染色体失活偏移是X-连锁遗传性聋的表型异质性的原因之一。3、smpx基因特异性表达于耳石膜及角质板,smpx表达缺失在一定程度上干扰内耳及侧线发育,导致耳石发育异常、毛细胞数量减少以及静纤毛发育异常,致使斑马鱼对声音刺激的应答减弱、活动度降低。4、smpx基因表达缺失可能通过p38MAPK信号通路介导毛细胞凋亡导致耳聋的发生。