研究背景间充质干细胞(MSCs)具有独特的低免疫原性和免疫调节作用。脂肪来源间充质干细胞(ASCs)具有取材方便、来源充足等优势,已成为MSCs领域的研究热点。研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在炎症微环境中高表达细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞间黏附分子1(VCAM-1),当封闭这些黏附分子或者促使这些黏附分子无法表达后,BMSCs的免疫抑制能力会显著降低。ASCs中仅高表达ICAM-1,ICAM-1是否对人ASCs的生物学特性以及免疫抑制功能发挥重要的调节作用还未见文献报道。此外,干扰素-γ(IFN-y)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1 β(IL-1 β)等细胞因子是BMSCs发挥免疫抑制活性不可缺少的“授权”因子,它们都可以增强BMSCs的免疫抑制能力,而这些细胞因子是否通过ICAM-1影响ASCs的免疫抑制功能尚待探讨。明确ICAM-1对ASCs的生物学特性及免疫抑制功能的影响,将为深入了解ASCs的免疫调节特性及临床应用提供新的理论依据。研究目的1.探讨ICAM-1对ASCs增殖、凋亡、周期、迁移以及成脂、成骨、成软骨分化等生物学特性的影响。2.探讨ICAM-1对ASCs免疫调节功能的影响。3.探讨TNF-α对ASCs中ICAM-I表达的影响及机制。4.探讨适合ASCs的最佳冻存液以及低温保存对ASCs免疫调节功能的影响。研究方法1.ICAM-1对ASCs生物学特性的影响采用胶原酶消化法从脂肪组织中获得ASCs,倒置显微镜下观察,成脂、成骨、成软骨分化诱导,流式细胞仪进行表面标志物检测。构建ICAM-1的敲减和过表达质粒,利用慢病毒感染的方法在ASCs中敲减和过表达ICAM-1,CCK-8法检测ASCs增殖,Muse细胞状态分析仪检测细胞凋亡和周期的变化,划线法和Transwell法检测细胞迁移能力的改变,分别使用油红O、茜素红和阿利新蓝对成脂、成骨、成软骨诱导后的ASCs进行染色以检测ASCs的分化能力。2.ICAM-1对ASCs免疫调节功能的影响提取外周血单个核细胞(PBMC),CFSE染色后,分别按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160的比例接种ASCs和PBMC,显微镜下观察ASCs对PBMC增殖的影响,流式检测ASCs对PBMC增殖的影响。按照1:10的比例分别以接触共培养和Transwell隔离共培养的方式接种ASCs和PBMC,显微镜下观察ASCs对PBMC增殖的影响,流式检测ASCs对PBMC增殖的影响。流式检测ICAM-1敲减组(shICAM-1组)、ICAM-1敲减对照组(shScramble组)、ICAM-1过表达组(ICAM-1-OV组)和ICAM-1过表达对照组(PCDH组)ASCs对PBMC增殖的影响。3.TNF-α对ASCs中ICAM-1表达的影响以及机制体外分别添加TNF-α和IFN--γ,以及转化生长因子-β1(TGF-β1)、单核细胞超化蛋白-1(MCP-1)、IL-1 β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 等细胞因子,流式检测 BMSCs和ASCs中VCAM-1和ICAM-1的表达。采用干细胞培养基、L-DMEM+FBS、L-DMEM+人血清、L-DMEM+血小板裂解液、F12培养基+FBS五种条件进行培养,流式检测不同培养条件下ASCs中ICAM-1的表达。干细胞培养基条件下对ASCs进行传代培养,流式检测P2到P9不同代数ASCs中ICAM-1的表达。采用P3代ASCs,流式检测0.1～100ng/mL不同浓度TNF-α对ASCs中ICAM-1的表达的影响。Reαl-time PCR和流式分别检测5ng/mL TNF-α在1h、3h、6h、12h、24h、48h时间点对ASCs中ICAM-1基因和蛋白表达量的影响。检测mTOR通路抑制剂PP242和Rapamycin、JNK通路抑制剂SP600125、MEK1/2通路抑制剂U0126和NF-κB通路抑制剂 BAY11-7082对ASCs中ICAM-1表达量的影响以及TNF-α导致ASCs中ICAM-1表达量变化的影响。4.不同配比冻存液对ASCs生物学特性及ICAM-1的表达和免疫调节功能的影响分别采用不同比例的FBS和DMSO组合的冻存液冻存ASCs,然后使用Muse细胞分析仪检测各组细胞的细胞活力;CCK-8法检测冻存组以及新鲜组ASCs增殖能力;流式检测冻存组以及新鲜组ASCs细胞表面标志物及ICAM-1的表达;油红O、茜素红和阿利新蓝染色分别检测冻存组以及新鲜组ASCs成脂、成骨、成软骨分化;流式检测95%FBS和5%DMSO冻存组和新鲜组ASCs对PBMC的体外增殖的影响。研究结果1.ICAM-1对ASCs生物学特性的影响P3代ASCs呈成纤维样贴壁生长,CD44、CD73、CD90与CD105等MSCs表面标志物均呈阳性表达,而CD45、CD34、CDllb、CD19和HLA-DR呈阴性表达,能够向成脂、成骨、成软骨三向分化。在培养第三天时,shICAM-1组ASCs的增殖能力显著高于shScramble组,而ICAM-1-OV组ASCs的增殖能力则低于PCDH组;敲减、过表达ICAM-1后的ASCs体外凋亡和细胞周期与对照组相比没有明显变化;划线法结果显示,shICAM-1组ASCs在6h、12 h和24 h细胞迁移距离明显大于shScramble组,ICAM-1-OV组ASCs在12 h细胞迁移距离明显小于PCDH组;Transwell法结晶紫染色结果显示,shICAM-1组ASCs在12 h和24 h细胞迁移数量明显多于shScramble组,ICAM-1-OV组ASCs在24 h细胞迁移数量明显低于PCDH组;油红O、茜素红和阿利新蓝染色结果显示敲减、过表达ICAM-1后ASCs体外成脂、成骨、成软骨分化能力无变化。2.ICAM-1对ASCs免疫调节功能的影响倒置显微镜下可见,PBMC经过PHA刺激后,呈聚集性生长增殖,而加入ASCs后PBMC聚集能力变弱,ASCs比例越高,PBMC的聚集成团能力越弱,ASCs对PBMC增殖的抑制作用与ASCs的比例成正比,ASCs与PBMC比例为1:10和1:20时,与不加ASCs组相比,差异有统计学意义接触共培养和隔离共培养时,ASCs都能够抑制PBMC的增殖,但接触共培养时,ASCs对PBMC增殖的抑制作用更强。shICAM-1组ASCs对PBMC增殖的抑制作用弱于shScramble组,PCDH组ASCs对PBMC增殖的抑制作用与ICAM-OV组相比没有统计学差异。3.TNF-α对ASCs中ICAM-1表达的影响以及机制TNF-α和IFN-y能够促进BMSCs中VCAM-1和ICAM-1的表达,但仅能促进ASCs中ICAM-1的表达。促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-1 β能够促进ASCs中ICAM-1的表达,IL-6、IL-8、MCP-1等促炎因子以及TGF-β1、IL-10、IL-13等抑炎因子则对ASCs中ICAM-1的表达无影响。干细胞培养基组、L-DMEM+FBS组、F12培养基+FBS组、L-DMEM+血小板裂解液组培养的ASCs中ICAM-1为低表达,而L-DMEM+人血清培养的ASCs中ICAM-1为中表达。随着传代次数的增加,ASCs中ICAM-1的表达也逐渐升高。ASCs 分别经过 0.lng/mL、0.5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、10ng/mL 的 TNF-α 刺激后,ICAM-1的表达也是逐渐升高,而从lOng/mL的浓度开始,20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100ng/mL的TNF-α对ASCs中ICAM-1的表达变化影响不再明显。流式结果显示,5ng/mL的TNF-α刺激ASCs后3h,ICAM-1表面蛋白表达开始升高,持续到48h。Real-time PCR结果显示,ASCs分别经过5ng/mL的TNF-α刺激lh后,ICAM-1基因的表达即开始升高,6h后逐渐下降。TNF-α主要通过NF-κB信号通路来调节ASCs中ICAM-1的表达,而mTOR通路、JNK通路以及MEK1/2通路对TNF-α引起的ASCs中ICAM-1的表达无明显影响。4.低温保存对ASCs生物学特性及ICAM-1的表达和免疫调节功能的影响冻存保护剂中,随着DMSO浓度的增加,ASCs的活力提高,90%FBS和10%DMSO组,95%FBS和5%DMSO组的细胞存活率相似。90%FBS和10%DMSO组,95%FBS和5%DMSO组低温保存的ASCs显示出与新鲜ASCs相似的增殖速率、细胞表面标志和分化能力。95%FBS和5%DMSO冻存组ASCs和新鲜组ASCs在抑制PBMC增殖方面没有统计学差异。研究结论1.敲减ICAM-1促进ASCs的增殖和迁移,过表达ICAM-1抑制ASCs的增殖和迁移,但敲减和过表达ICAM-1对ASCs凋亡、周期和分化无影响。2.ASCs对PBMC有免疫抑制作用,ASCs与PBMC接触共培养时,ASCs对PBMC增殖的抑制作用更强,敲减ICAM-1后ASCs对PBMC的免疫抑制能力降低。3.ASCs在不同的培养条件以及不同的代数时,ICAM-1的表达不同;TNF-α和IFN-γ能够促进BMSCs中ICAM-1和VCAM-1的表达,TNF-α、IFN-γ和IL-1 β能够促进ASCs中ICAM-1的表达;ASCs中ICAM-1的表达随着培养条件中TNF-α浓度的增加而升高,在达到10ng/mL及以上浓度时,ICAM-1的表达变化不再明显;TNF-α主要通过NF-κB信号通路来调节ASCs中ICAM-1的表达。4.低温保存能够维持ASCs的活性、增殖能力、表面标志、分化及免疫调节潜能;95%FBS和5%DMSO组合是ASCs低温保存的理想冻存保护剂。