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目的:预测胶质瘤相关抗原MAGE-D4的HLA-A2限制性T细胞抗原肽,分析这些抗原肽负载DC后是否能诱导出具有肿瘤杀伤作用的T细胞,为MAGE-D4的胶质瘤免疫治疗提供实验依据。方法:(1)MAGE-D4表位肽的预测:利用SYFPEITHI和BIMAS网站,分析HLA-A*0201限制性MAGE-D4 T细胞抗原肽,筛选高得分的候选肽;(2)肽-HLA-A2亲和力检测:合成筛选出的抗原肽,将抗原肽与T2细胞孵育,流式细胞仪检测HLA-A2表达荧光强度,分析抗原肽肽与HLA-A2的亲和力;(3)HLA-A*0201表型的筛选鉴定:提取胶质瘤细胞U87的DNA,用HLA-A*0201特性引物进行PCR鉴定;分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞仪筛选HLA-A2健康志愿者。(4)树突状细胞(DC)的体外诱导培养及鉴定:分离HLA-A*0201健康志愿者的外周血PBMC,使用磁珠分选法从PBMC中分离出CD14+细胞,将用细胞因子(rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a)与CD14+细胞孵育,诱导出成熟的DC,并通过形态学观察、细胞表面标志物(CD83,CD80,CD1a和HLA-DR)的流式细胞术检测对DC进行鉴定。(5)MAGE-D4抗原肽负载DC的制备:将细胞因子诱导培养至第3和第5天的DC用MAGE-D4抗原肽刺激,继续培养至第8天,收集MAGE-D4抗原肽负载DC;(6)效应T细胞的制备:T细胞磁珠分选试剂盒分离HLA-A*0201健康志愿者PBMC中的T细胞,将T细胞与MAGE-D4表位肽负载的DC(T细胞:DC为10:1)孵育,培养至第4天,再以同样的比例与MAGE-D4抗原肽负载的DC孵育,并加入IL-2继续培养4天,然后分别CCK-8和ELISPOT检测T细胞的增殖和分泌INF-γT细胞的频数。(7)效应T细胞杀伤实验:以10:1、20:1的效应细胞:靶细胞孵育,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定效应T细胞对U87细胞的杀伤作用。结果:(1)通过网站预测出HLA-A*0201限制性候选肽,序列如下:P1(SLLLVILGV),P2(LLQERANK),P3(CLPPPNVIL),P4(ILSNEPWEL)和P5(RLSLLLVIL);(2)流式细胞仪检测结果显示,除P1外,其余4个肽均与HLA-A*0201分子具有较好的亲和力(FI大于1)。(3)通过PCR检测确定U87细胞为HLA-A*0201表型,通过流式细胞仪筛选出HLA-A2健康志愿者。(4)CD14+细胞经细胞因子诱导后,呈现出典型的DC形态,并高表达CD1a,CD83,CD80和HLA-DR分子。(5)MAGE-D4抗原肽负载DC孵育T细胞后,CCK-8检测结果显示T细胞增殖,但各组间无统计学差异。IFN-γELISPOT检测结果显示分泌IFN-γ的T细胞显著增加,与对照组比较具有统计学差异(P<0.05)。(6)LDH检测结果显示,当效靶比为20:1时,负载P2-DC+TC组、P3-DC+TC组、P4-DC+TC组和P5-DC+TC组的效应性T细胞对U87细胞杀伤效率均明显高于未负载多肽的DC+TC组(P<0.05);其中P3-DC+TC组、4-DC+TC组和P5-DC+TC组的杀伤效果随效靶比的增大而增强(P<0.05)。结论:MAGE-D4抗原肽(LLQERANK,CLPPPNVIL,ILSNEPWEL,RLSLLLVIL)致敏的DC可在体外诱导出具有杀伤肿瘤细胞的T细胞,提示这些MAGE-D4抗原肽具有用于胶质瘤免疫治疗的潜力。