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运用细胞生物学及分子生物学方法，研究内皮素－1（Endothelin-1, ET-1）对人血管平滑肌细胞增殖的影响，由五个部分组成。 第一部分 内皮素－1对人血管平滑肌细胞增殖的影响 ET－1是一个潜在的缩血管物质。最近研究表明，ET－1可以促进细胞增殖。我们拟研究ET－1对人血管平滑肌细胞增殖的影响。用MTT法观察ET－1及PD98059对平滑肌细胞生长的影响；[3H]-TdR法观察ET－1对血管平滑肌细胞DNA合成的影响；流式细胞仪法观察ET－1对血管平滑肌细胞周期的影响。首先，与对照组和PD98059组比较，ET－1刺激血管平滑肌细胞生长(P<0.05)。第二，与对照组比较，ET－1促进血管平滑肌细胞DNA合成(P<0.05)。第三，ET－1促进细胞周期由G0/G1向S期的转变。与对照组比较，G0/G1 细胞百分比明显减少(P<0.05)。与对照组比较，S期细胞百分比明显增加(P<0.05)。研究表明，ET－1促进人血管平滑肌细胞增殖。第二部分 内皮素－1对人血管平滑肌细胞表型转变的影响 血管平滑肌细胞表型可从收缩型向合成型转变，而使细胞处于增殖状态。我们探讨了ET－1对血管平滑肌细胞表型和增殖变化影响的相互关系。l-CaD（low-Caldesmon）在合成型平滑肌细胞中出现，h－CaD(high-Caldesmon)在收缩型平滑肌细胞中出现。我们使用逆转录聚合酶链反应方法研究。细胞培养第一天，血管平滑肌细胞呈现h－CaD表型，第二天h－CaD表达减弱，第三天消失(P<0.05)。ET－1刺激人血管平滑肌细胞l-CaD表型在第二天微弱表达，以后表达逐渐增强，且具有时间依赖性，第六天l-CaD表达达到最大值(P<0.05)。这些结果说明，ET－1抑制人血管平滑肌细胞h－CaD表达，促进l-CaD表达。研究表明，ET－1促进人血管平滑肌细胞由收缩型向合成型的转变，ET－1促进血管平滑肌细胞表型变化。<WP=4> 第三部分 内皮素－1 对人血管平滑肌细胞细胞周期进程的影响 虽然ET－1在血管重构中作为缩血管、有丝分裂刺激作用有研究，但关于ET－1诱导人血管平滑肌细胞周期进程的机理研究还很少。我们运用蛋白印迹方法，研究ET－1对血管平滑肌细胞细胞周期进程的影响机制，观察细胞周期蛋白及细胞周期激酶抑制蛋白变化。细胞周期调节蛋白D1表达，在ET-1刺激后16小时出现，表达在32小时达到高峰，40小时表达稍有减低(P<0.05)。细胞周期调节蛋白A表达，在ET-1刺激后24小时出现，表达在40小时达到最大值(P<0.05)。细胞周期激酶抑制蛋白p27kip1表达降低在ET-1刺激后8小时出现，40小时表达达最低值(P<0.05)。没有ET-1刺激组，p27kip1的表达没有变化。结果显示,ET－1增加细胞周期蛋白D1、A表达，且具有时间依赖性。ET－1抑制p27 kip1表达，也具有时间依赖性。研究表明,ET－1刺激人血管平滑肌细胞增殖依赖于细胞周期的变化。第四部分 内皮素－1对人血管平滑肌细胞MEK/ERK通路和内皮素受体A表达的影响许多研究表明，内皮素受体 A 和丝裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶1、2是细胞增殖的重要信号传导通路。我们运用蛋白印迹方法，观察ET－1诱导的人血管平滑肌细胞增殖中MEK/ERK、ETA受体的表达情况。MEK磷酸化出现在ET-1刺激后第五分钟，表达在第十五分钟达到最大值，30分钟表达稍有减低(P<0.05)。ERK磷酸化出现在ET-1刺激后第五分钟，表达在第十五分钟达到最大值,30分钟表达稍有减低(P<0.05)。ETA表达在ET-1刺激后8小时激活，表达在32小时达到最大值，40小时表达稍有减低(P<0.05)。而非磷酸化MEK/ERK水平没有变化(P>0.05)。结果显示，ET－1增加MEK/ERK磷酸化水平，且具有时间依赖性。ET－1促进ETA受体表达，且具有时间依赖性。研究表明，MEK/ERK通路和ETA激活在ET－1诱导的血管平滑肌细胞增殖中起重要作用。第五部分 内皮素－1对人血管平滑肌细胞增殖调节的通路 运用蛋白印迹方法,研究ET－1诱导血管平滑肌细胞增殖过程MEK/ERK、ETA、细胞周期进程三者之间相互关系及相互作用。运用MEK抑制剂PD98059进行一系列研究。细胞周期调节蛋白D1的表达出现在PD98059作用后24小时，<WP=5>表达最大值在40小时(P<0.05)，与ET-1组比较有明显差异(P<0.01)。细胞周期调节蛋白A的出现微弱的表达在PD98059作用后24小时，表达最大值在40小时(P<0.05)，ET-1组比较有明显差异(P<0.01)。PD98059刺激下，p27kip1表达没有降低，同ET-1组比较有明显差异(P<0.01)。MEK磷酸化水平在PD98059作用后10分钟，最大值在30分钟(P<0.05)，与ET-1组比较有明显差异(P<0.01)。ERK磷酸化水平在PD98059作用后15分钟，最大值在30分钟(P<0.05)，与ET-1组比较有明显差异(P<0.01)。结果显示，PD98059能抑制细胞周期调节蛋白D1、A的表达，PD98059抑制ET-1诱导的p27kip1表达减低，PD98059对ETA受体的表达没有影响(P>0.05)。研究证明，ET－1诱导的细胞周期进程与MEK/ERK通路有关，而且可以说部分是被MEK/ERK调节的。但与ETA受体的表达无关，这可能说明除了MEK/ERK通路外，可能还有其它信号通路参与血管平滑肌细胞增殖调节。我们希望通过以上几个部分研究，能为临床防治再狭窄等疾病提供一些依据。