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随着中药研究的不断深入,研究者发现了越来越多具有良好发展前景的难溶性中药活性成分,但由于其溶解性差、口服吸收不完全,导致口服生物利用度低且变异性较大,从而限制了其临床应用。基于提高难溶性中药活性成分口服生物利用度的目的,本文以名贵中药蟾酥中提取的活性成分蟾毒灵(bufain,BF)为模型药物,运用生物药剂学原理和方法设计并制备了两种脂质微粒分散给药系统:BF自微乳化给药系统和麦胚凝集素(WGA)修饰脂质纳米粒给药系统,对药剂学性质进行了评价,初步探讨了脂质微粒分散给药系统提高难溶性药物生物利用度的作用机制。具体研究内容如下:
处方前研究和大鼠在体肠吸收研究结果表明BF属于生物药剂学分类系统中第Ⅱ类药物(低溶解性、高渗透性),BF全肠段吸收,但无特定吸收部位,吸收机制为被动扩散,外排蛋白P-gp对BF小肠吸收无显著影响。以上结果提示在剂型设计上可以通过增加药物溶解度和制剂的溶出速度来提高生物利用度,为BF口服脂质微粒分散给药系统的研究提供了必要的生物药剂学基础。
根据BF在油相、表面活性剂和助表面活性剂中平衡溶解度以及三元相图研究结果,确定了BF自微乳化给药系统的基本处方组成,并采用星点设计-效应面法结合归一化法对处方进行了优化。优化后的处方组成为油相Maisine35-1/Miglyol812 N(1:1,w/w)29.5％,表面活性剂Cremophor EL39.5％,助表面活性剂Transeutol P30.5％;所得的自微乳制剂遇水分散形成的微乳液滴圆整、平均粒径为33.9 nm,平均自乳化时间为2.2 min;在体外脂质消化条件下作用45 min,约80％以上药物保持溶解状态,揭示自微乳制剂具有一定的抵御药物沉淀析出的能力;采用MTT法考察了自微乳制剂及其辅料对Caco-2细胞的细胞毒性作用,表面活性剂与助表面活性剂在浓度低于1％时均无显著细胞毒性作用;与相同浓度的药物溶液相比,含药自微乳制剂明显降低了细胞毒性,表明白微乳制剂组分不仅有助于微乳形成而且还有助于降低细胞毒性。
针对脂质纳米粒的局限性,制备了WGA修饰脂质纳米粒(WGA-LNPs),旨在增加纳米粒的胃肠道生物黏附性并促进细胞摄取,以达到进一步促进口服吸收、提高生物利用度的目的。首先采用高压均质法制备BF脂质纳米粒,然后利用附着在脂质纳米粒表面聚乙烯醇的羟基为功能基团,采用戊二醛法将WGA共价结合到脂质纳米粒表面。透射电镜下观察WGA-LNPs为近圆形或椭圆形,平均粒径为164 nm,zeta电位为.10.6 mv,包封率为68.2％。红细胞凝集试验发现WGA-LNPs能够使红细胞凝集,证实其具有一定的生物活性。
为了研究WGA-LNPs与肠上皮细胞的结合特性并探讨其作用机制,本文采用Caco-2单细胞层,考察载香豆素-6脂质纳米粒、非特异性蛋白BSA修饰脂质纳米粒和WGA-LNPs与细胞的结合情况。以上制剂与细胞结合量均随时间延长而增加,WGA-LNPs与细胞的结合作用高于前两者约1.5倍,表明WGA促进了脂质纳米粒与细胞之间的相互作用;4℃时WGA-LNPs与细胞的结合能力显著低于37℃时的结合行为,揭示部分WGA-LNPs经由主动转运进入细胞;以N-乙酰-D葡萄糖胺作为WGA特异性结合单糖,加入N-乙酰-D葡萄糖胺显著降低细胞与WGA-LNPs的结合效率,证实了WGA-LNPs与Caco-2细胞层结合具有一定的特异性;采用激光共聚焦显微镜观察,细胞摄取的纳米粒主要分布于细胞浆,摄取量随时间延长而增加,且WGA能促进细胞对脂质纳米粒的摄取。
大鼠体内药动学研究结果表明:以混悬剂为参比制剂,BF自微乳制剂和WGA-LNPs的口服相对生物利用度分别为238.4％和267.5％,均显著提高了BF大鼠口服生物利用度(P＜0.05)。
推测两种脂质微粒分散给药系统对药物具有较好的溶解能力,其对药物经细胞内和细胞间转运以及经淋巴系统转运的促进作用均有助于提高药物的生物利用度;而WGA-LNPs的作用机制还涉及:1)细胞膜表面糖蛋白受体介导的内吞作用;2)细胞对纳米粒的吞噬作用;3)流体相内吞作用。