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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是迄今为止研究和应用最为广泛的一类微生物杀虫剂。Bt的杀虫活性主要来自于生长过程中产生的伴孢晶体蛋白,亦称杀虫晶体蛋白ICPs(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)。ICPs的杀虫活性与氨基酸及结构间的关系是目前研究的热点。Cry1Ba3是由本实验室发掘的对小菜蛾有高毒力的杀虫晶体蛋白。为了寻找对杀虫活性有重要影响的氨基酸,本研究通过以下几个步骤对Cry1Ba3进行了分析:在Swiss—Model数据库中,对Cry1Ba3的三维结构进行同源建模,初步确定Cry1Ba3三个主要结构域的位置:DomainⅠ位于1~270,DomainⅡ位于280~480,DomainⅢ位于500~630。采用BioEdit软件分析Cry1Ba3的疏水区,发现在60~80, 260~263, 397~404三个疏水区。最后,将Cry1Ba3与Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1以及Cry4Ba1进行多序列比对,从而确定了40个突变位点。利用半重叠引物PCR的方法对Cry1Ba3进行定点突变,获得40个突变体(Ms~M39),并在大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli) BL21中进行诱导表达。将获得的突变蛋白采用浸叶法进行小菜蛾和大猿叶甲生物活性测定,实验结果表明:突变体M6(R171L)、M10(W282A)、M19(H485G)对小菜蛾的活性明显降低,其中突变蛋白M6(R171L)的活性完全丧失,突变蛋白M10(W282A)的活性降低49倍,突变蛋白M19(H485G)的活性降低44倍。将所有突变及野生型蛋白序列提交到P?le Bio-Informatique Lyonnais网站的NPS@数据库进行SOPMA二级机构预测。通过对结果的分析发现,活性没有明显变化的突变对蛋白的结构的普遍没有影响,而活性变化明显的突变均对蛋白的局部结构产生不可逆的改变。本研究确定了三个Cry1Ba3的杀虫活性有重要影响的关键氨基酸,能够今后关于机理方面的研究提供方法以及理论方面的参考;同时还能为今后合成全新的高毒力广谱杀虫蛋白理论依据,为提高农业生产及节省科研资源作出一定的贡献。