研究背景与目的原发性肝癌是全世界第六大常见癌症,也是肿瘤相关性死亡的第三大原因,原发性肝癌中最常见的类型是肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC),大约80%的肝癌病例病因学是与慢性乙型和丙型肝炎病毒感染相关的。原发性肝癌在亚洲和非洲最常见,其发病率在西方国家也在不断上升。目前,一线根治疗法包括手术切除和肝移植。但由于肝癌极具侵略性,而目前一线及二线治疗措施的疗效都比较差,每年全球因肝癌死亡的人数和发病的人数基本持平。此外,由于肝癌的特点是肿瘤细胞的生长速度快,早期便可出现肝转移,肿瘤恶性程度高以及多药耐药,其5年生存率一般在5%之内。研究显示,目前国内外已知大量和肝细胞癌生长和侵袭相关的生物学标志物,但其中大部分都并不具有实用性,这也是为什么科学界仍积极探索该领域的原因——这两年仍有大量的相关论文发表(2012年在pubmed上用关键词“肝癌”和“标志物”搜一下,可以搜出740多条内容,今年则是2766条)。基因转录是最重要的生命过程之一,转录因子(transcription factor,TF)在此过程中的作用极大,活化的转录因子(activating transcription factor, ATF)属于具有碱性亮氨酸拉链区域的大家族,在多种组织及肿瘤细胞株的mRNA水平均广泛表达。活化转录因子4(ATF4)是其中重要的一个成员。多种微环境的应激均可引起ATF4表达上调,包括氨基酸耗竭、氧化应激和内质网应激这些可以被上游真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factors2α, eIF2α)蛋白激酶所感受到的微环境的变化。在肿瘤中,只要是可以促进新陈代谢稳态和通过转录调节氨基酸摄取和生物合成,自噬,氧化还原平衡和血管生成而生存的肿瘤细胞中,缺氧及营养剥夺区域均可检测到ATF4的表达。但ATF4在肿瘤中的作用,特别是ATF4与肝癌患者生存期、预后关系以及其对肝癌肿瘤细胞的影响及机制目前未见系统报道,因此十分有必要进行研究。microRNA(miRNA)是小的(约18-25个核苷酸)非编码双链RNA,具有通过减少mRNA的翻译来调节靶基因的能力,而且还可诱导mRNA降解以及染色质的重构。在过去的几年中,miRNA在肝癌病程发展中所起的作用越来越引人关注。由于miRNA控制基因表达行为的能力就像抑癌基因或致癌基因一样强大,miRNA被认为在癌变中起了至关重要的作用。许多miRNA在控制细胞增殖、凋亡和侵袭以及在促肿瘤生成中的去调控相关作用中起了非常关键的作用。我们的实验研究了ATF4以及niRNA4458和肝癌患者生存期的关系,包括其对肝癌细胞系的影响。并希望能够为临床上肝癌患者提供新的分子标记物来作为预后预测或是潜在治疗方法。实验方法一、ATF4对肝癌细胞的抑制作用及其初步分子机制研究1、采用Real time PCR方法比较ATF4在30对HCC组织/癌旁组织中的表达情况,以GAPDH作为内在参照物。采用Real time PCR方法检测人正常肝细胞、肝肿瘤细胞株L-02,Huh7,HepG2等细胞株中ATF4的表达情况。2、采用组织芯片免疫组化实验测定ATF4蛋白在222对HCC组织和对照配对癌旁组织中的表达情况。3、采用免疫组织化学方法结合病历资料进行统计学分析。4、采用细胞计数试剂盒和克隆形成测定法测定过表达ATF4后对肝癌细胞增殖能力的影响；氧化敏感探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平；采用膜联蛋白(Annexin)—碘化丙啶(PI)双染色方法检测凋亡水平的变化。二、miR-4458对肝癌细胞的抑制作用及初步分子机制研究1、qRT-PCR分析miR-4458在正常肝脏细胞、L-02、HepG2、Chang、Hep3B、 SMMC-7721和Huh-7肝癌细胞中的表达；MiR-4458的量化是以U6为内参；30例HCC患者组织及其癌旁配对组织的miR-4458表达由qRT-PCR法测定并比较；40例HCC患者样本的miR-4458表达由qRT-PCR法测定并排序,分析肝癌患者术后总体生存期的Kaplan-Meier曲线和miR-4458表达水平之间的关系；2、使用miR-4458类似物在SMMC-7721和Huh-7细胞过表达miR-4458,使用miR-4458抑制剂在L-02细胞下调抑制miR-4458,qRT-PCR试剂盒确定转染后48h及72h后的RNA水平,标准化内参为小核RNA U6,进而使用MTT,流式等方法检测调控miR-4458对肝癌细胞增殖、存活等生物效应的影响。3、生物信息学分析预测miR-4458抑制肝癌细胞生长的潜在靶基因,双荧光质粒报告系统确定目的基因。4、确定miR-4458的靶基因B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子(IKBKE)的表达与肝癌患者总体生存期的关系。5、采用组织芯片免疫组化实验测定IKBKE蛋白在222对HCC组织和对照配对癌旁组织中的表达情况并分析IKBKE表达水平与肝癌患者生存期的关系；采用瞬时转染实验分析过表达IKBKE对miR-4458功能的抑制作用。三、统计学处理只有两组进行比较时,采用双尾t检验分析组间差异。比较三个或三个以上的组间差异采用方差分析。相关性分析由PEARSON相关系数法进行分析。患者的总生存期估计采用Kaplan-Meier法。统计分析采用SPSS软件(16.0版本)进行。P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异显著。结果一、mRNA在人肝癌组织及肝癌细胞系中表达明显下调；二、采用组织芯片免疫组化实验发现ATF4蛋白在222对HCC组织中表达水平显著低于对照配对癌旁组织,P<0.01；三、ATF4表达水平与HCC肿瘤大小呈负相关；四、过表达ATF4抑制肝癌细胞增殖并降低肝肿瘤细胞克隆形成能力；诱导HepG2细胞周期阻滞；上调肝癌细胞ROS水平显著促进肝癌细胞凋亡。五、抑制ATF4的表达则促进L02细胞增殖,与过表达实验一致；六、HCC组织中的miR-4458低表达；七、miR-4458低表达的HCC患者生存期缩短；八、过表达miR-4458抑制了HCc细胞在体外的增殖；九、下调miR-4458的表达促进正常肝细胞的增殖；十、miR-4458抑制肝癌细胞增殖的一个重要直接靶基因是IKBKE;十一、IKBKE在HCC中表达增高且和肝癌患者生存期相关。十二、miR-4458通过抑制其直接靶基因IKBKE的方式抑制肝癌细胞增殖。结论一、我们发现ATF4在肝癌组织及肝癌细胞系中均表达明显下调,且过表达ATF4可以显著抑制肝癌细胞增殖；ATF4表达水平与肿瘤大小呈负相关,与HCC患者生存期也有一定的相关性,以上研究均表明,ATF4可能是HCC患者预后的预测因子。二、我们的实验明确了miR-4458在HCC中的作用：miR-4458在HCC中表达显著下调,过表达miR-4458可以显著抑制肝癌细胞增殖,其中的部分分子机制是miR-4458通过抑制其直接靶基因IKBKE的方式实现的。IKBKE在HCC中表达增高且和肝癌患者生存期相关。我们认为miR-4458和IKBKE都可能是HCC患者预后的重要预测因子以及HCC的新的潜在治疗靶点。