传统生殖发育毒理学试验的优点是能够将生殖周期的研究拆分为不同的生物学过程,对其进行单一或组合研究或延续的研究,从而对化学品的靶器官特异性及其机制进行鉴定,更好地解释化学品的生物学特性。但其缺点也是非常明显的,例如耗资巨大、试验周期过长、所需试验动物过多等。如果要实施现行完整的生殖毒性研究(包含二代生殖毒性研究),一次大约需要五千多只动物。随着科学技术的发展,组合化学(combinatorial chemistry)、计算机辅助药物设计等新技术的应用使新化学物质日益增多,而传统的生殖发育毒理学评价方法面临新的挑战,加上全世界每年用于实验的动物数以千万计,从而引发了各国动物保护组织的强烈抗议。上述因素极大的推进了3R理论,即减少(Reduction)、替代(Replacement)和优化(Refinement)试验动物的倡导与实施,并积极促进了生物医学研究模式的转变。因此,替代传统动物实验的生殖毒性体外评价模型研究已经成为毒理学发展的重要方向,并已在一系列的试验中发挥了举足轻重的作用,但由于哺乳动物拥有复杂的生殖周期,采用生殖与发育毒性替代法研究最后取得成功的案例很少。由于雌性生殖过程的复杂性远远超过雄性,这使得化学物质雌性生殖毒性的预测与研究比较困难,因此建立一个既能快速筛选、检测和鉴定具有雌性生殖毒性化合又能研究其作用机制的体外替代模型,对防治化学物质引起的生殖系统损伤具有十分重要的意义。卵巢颗粒细胞(Granulosa cell GC)是卵泡内的最大细胞群,也是主要的功能细胞。GC迅速生长及增殖是卵泡发育的显著标志之一,而成年动物的卵泡闭锁,特别是在卵泡发育后期,主要是由GC凋亡引起。此外,GC与卵泡膜细胞共同完成卵巢激素的合成,维持卵母细胞生长和成熟的微环境。由此可见G；C的增殖、凋亡及激素分泌与卵泡发育、卵母细胞成熟密切相关。本课题根据雌性动物的生殖生理特点,以体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞为实验对象,应用细胞技术对外源性化合物进行生殖毒性筛选和安全性评价,探讨卵巢颗粒细胞应用于生殖毒性评价的可靠性与可行性,并将其应用于T-2毒素生殖毒性机制的研究中。目的：建立大鼠卵巢颗粒细胞体外培养体系,探讨其用于雌性生殖毒物鉴定和机制研究的可行性。以体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞为研究对象,从线粒体通路和PKA通路探讨T-2毒素引起颗粒细胞损伤的相应机制。方法：对未成年的Wistar大鼠卵巢颗粒细胞进行原代培养,并应用HE染色和免疫细胞化学法对所获取的细胞进行鉴定；在此基础上,选择具有卵巢毒性的化合物环磷酰胺、白消安、氯丙嗪和T-2毒素对GC进行染毒试验,染毒结束后通过采用MTT法检测细胞相对活力、DNA荧光染料Hoechst 33258检测颗粒细胞的凋亡率、ELISA法检测细胞孕酮(P)和雌二醇(E2)的分泌情况,从而研究上述化合物的细胞毒性；从中选取具有明显细胞毒性的化合物,应用DNA-Ladder检测细胞凋亡,半定量RT-PCR检测凋亡调控基因Bax、Bcl-2和P53 mRNA以及激素分泌相关调控基因FSHR、StAR、P450scc和P450arom mRNA的表达,免疫细胞化学染色法检测颗粒细胞中特异性受体卵泡刺激素受体(FSHR)的表达。在此基础上对未成熟Wistar大鼠卵巢颗粒细胞进行原代培养,T-2毒素染毒24后进行以下实验,常规方法检测细胞中SOD、CAT和GSH-Px的活力以及MDA的含量；荧光探针H2-DCFDA和Rh 123分别检测细胞内ROS生成和线粒体膜电位的变化；ELISA法检测T-2毒素对PKA通路激活剂FSH、CT、Forsklin、8-Br-cAMP、EGF、Anisomycin、22R-HC和pregnenolone诱导的孕酮和cAMP合成的影响；Western blot检测凋亡相关蛋白P53、Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9以及类固醇激素合成的相关蛋白酶AC、StAR、3β-HSD、P450scc和P450arom的表达水平；分光光度法检测caspase-3和caspase-9的活力；结果：(1)原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞,体外培养24h后,细胞贴壁生长,胞质富含颗粒,经鉴定纯度超过90%；(2)环磷酰胺和白消安不能抑制颗粒细胞体外增值和激素分泌,对细胞凋亡也没有明显的诱导作用；(3)氯丙嗪和T-2毒素则能够显著抑制颗粒细胞体外增值,干扰其激素分泌,并诱导细胞凋亡,呈浓度依赖关系；(4)随着氯丙嗪剂量的增高,在高剂量组出现非常典型阶梯状DNA Ladder, RT-PCR检测显示氯丙嗪能引起Bcl-2、Bax、P53、FSHR mRNA表达水平和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值的增高、StAR mRNA表达水平的降低,与对照组比较,除0.1μM剂量组的Bax、FSHR mRNA表达水平和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值无明显改变外(P>0.05),其余各组均有统计学意义(P<0.01)。此外，氯内嗪在一定浓度范围内(0.1μM-1μM)，能够促进P450scc和P450arom mRNA的表达,当氯丙嗪浓度达到10μM时,P450scc和P450arom mRNA的表达水平虽略有下降,但与1μM的中剂量组比较并无明显异(P>0.05); FSHR免疫细胞化学染色是卵巢颗粒细胞的一种特异性染色,结果显示不同浓度的氯丙嗪均能够促进颗粒细胞FSHR的表达(P<0.05),并呈现一定的剂量-效应关系；(5)随着T-2毒素剂量的增高,在高剂量组出现非常典型阶梯状DNA Ladder, RT-PCR检测显示T-2毒素能引起Bcl-2、Bax、P53、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值的增高,与对照组比较,除0.1μM剂量组外其余各组均有极显著差异(P<0.01),StAR mRNA表达水平则显著降低(P<0.01),FSHR mRNA的表达水平基本没有受到影响(P>0.05)；此外,T-2毒素在一定的浓度范围内(0nM-1nM),能够促进P450scc mRNA和P450arom mRNA的表达,然而当T-2毒素浓度达到10 nM和100nM时,P450scc和P450arom mRNA的表达水平则明显降低,与lnM剂量组比较差异显著(P<0.05); FSHR免疫细胞化学染色显示不同浓度的T-2毒素均能够显著促进颗粒细胞FSHR的表达(P<0.01),并呈现一定的剂量-效应关系；(6)T-2毒素能剂量依赖性地增加颗粒细胞内ROS的生成和MDA含量,降低SOD、CAT和GSH-Px的活性以及线粒体膜电位,促进凋亡相关蛋P53、Bax、Bcl-2和Bax/Bcl-2表达水平的上升以及caspase-3和caspase-9的活化,caspase-9抑制剂AC-LEHD-CHO和自由基清除剂Irolox均能在一定程度上抑制由T-2毒素诱导的颗粒细胞凋亡；(7)T-2毒素能剂量依赖性的抑制颗粒细胞内cAMP的合成,除Forsklin外,FSH和CT均不能抵消T-2毒素对cAMP合成的抑制作用。除22R-HC和pregnenolone外,FSH、CT、Forsklin、8-Br-cAMP、EGF、Anisomycin均不能抵消T-2毒素对颗粒细胞孕酮合成的抑制作用。随着T-2毒素染毒剂量的升高,AC、StAR和3β-HSD的蛋白表达水平显著下降。与对照组相比,低剂量的T-2毒素(0nM-1 nM)能够促进P450scc和P450arom的表达,但随着染毒剂量的升高(10nM-100nM),其蛋白表达水平则随之下降。结论：本研究用通过建立的大鼠卵颗粒细胞体外培养体系研究了四种卵巢毒物对颗粒细胞的细胞毒性,初步验证了大鼠卵巢颗粒细胞体外生殖毒性评价替代模型用于雌性生殖毒物鉴定与机制研究是可行性。T-2毒素则通过氧化应激诱发了卵巢颗粒细胞凋亡,而ROS介导的线粒体通路在这一凋亡过程中起着非常重要的作用；PKA通路则在T-2毒素抑制卵巢颗粒细胞甾体激素分泌过程中起着非常重要的作用,其中AC、StAR、和3p-HSD是T-2毒素作用的关键位点。