【研究背景】近年来,淋巴结转移对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）患者的分期,治疗和预后具有重大的影响。根据最新第8版NCCN中TNM分期指南,在无远处转移的前提下,存在淋巴结转移的患者属于Ⅲ期CRC,而无淋巴结转移的患者属于Ⅰ-Ⅱ期。对于T1期早期CRC患者,存在淋巴结转移时,治疗方式只能选择手术切除,而不具有淋巴结转移和无其他高危风险可以采用内镜下治疗。术后化疗方面,Ⅲ期患者选择联合化疗方案,而Ⅰ期患者无需采用化疗,对于Ⅱ患者,无高危因素的采取观察治疗,有高危因素的采用联合化疗方案,而淋巴血管侵犯属于高危因素。在预后方面,Ⅲ期淋巴结转移的CRC患者总体预后要差于Ⅰ-Ⅱ期的患者。随着精准医学的发展,精确的术前分期对结直肠癌患者诊疗方案的制定极其重要,N分期已经成为临床医生制定手术方案和术后放化疗方案的重要参考。越来越多的文献表明阳性淋巴结数目不能准确代表患者淋巴结转移情况和患者的生存情况。目前,在淋巴结分期的研究中,主要存在以下几种参数:TNM中的N分期,阴性淋巴结数目（Negative lymph nodes,NLNs）,淋巴结比率（Lymph node ratio,LNR）,对数转化的阳性淋巴结方案（Log odds of positive lymph nodes scheme,LODDS）。研究者一致表明在CRC中LODDS的预测准确性和特异性优于其他淋巴结参数。在预后方面,结直肠癌的肿瘤标志物（CEA,CA199,CA125）也已确定成为结直肠癌预后的关键因素,对结直肠癌预后的评价和治疗方案的指导具有很重大的临床意义。肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌的特异性抗原,代表肿瘤细胞增殖和远处播散的能力,而淋巴结转移是肿瘤组织发生局部转移和播散的产物。因为二者反映肿瘤不同层次和水平,而且二者相互独立,因此联合LODDS和标志物可以提高对CRC患者预后预测的准确性。由于淋巴结转移在肿瘤治疗和预后具有较大的临床意义,因此精准的淋巴结分期,尤其是术前淋巴结分期对结直肠患者的指导意义巨大。目前,传统的影像学检查仍是结直肠癌患者术前诊断的重要方法,但有学者认为其诊断价值有限,特别是当出现淋巴结的形态未改变的微转移。外泌体作为液体活检的主要成员,具有浓度高,稳定,容易收集,富含肿瘤基因组和突变特征的优点,有望成为新的结直肠癌的预测甚至是治疗的靶点。外泌体是直径为30-150 nm的磷脂双层纳米囊泡,由多种细胞（包括肿瘤细胞）分泌的,包含大量的蛋白质,脂质和核酸的囊泡,并能作为信号分子传递给受体细胞从而改变其细胞功能。在肿瘤研究中,外泌体也发挥着十分重要的作用,如促进肿瘤的生长与迁移,免疫逃逸,血管生成,化疗耐药等等。已有文献表明在外泌体中,Lnc RNA较为稳定而且与肿瘤发生发展密切相关。外泌体lnc RNA与临床肿瘤转移的相关性已被多次报道。然而在CRC淋巴结转移中外泌体lnc RNA的研究较少,而且机制未深入阐述。【研究目的】（1）在CRC临床数据中,建立淋巴结转移与肿瘤标志物联合的预后模型,以验证淋巴结转移在预后方面的贡献。（2）筛选CRC淋巴结转移相关的外泌体lnc RNA,并探索其生物学功能。【研究方法】（1）搜集2014-2016年患者的临床信息,电话和门诊随访患者并计算生存时间;（2）严格按照纳入排除标准,分析研究对象的基线资料;（3）单因素Cox回归分析与预后相关的因素,多因素Cox回归分析并建立淋巴结转移参数（LODDS）与肿瘤标志物的联合预后模型;（4）预后模型的评价:Receiver operating characteristic（ROC）曲线,生存分析,临床决策分析（Decision curve analysis,DCA）,亚组分析;（5）预后模型的临床运用:列线图及校正图;（6）分析CRC淋巴结转移和未转移的测序结果,筛选差异倍数较大的前5个外泌体lnc RNA;（7）收集结直肠癌患者血浆,进行外泌体提取和鉴定;（8）RT-PCR检测外泌体lnc RNA在淋巴结转移组和未转移组的差异水平,RT-PCR检测外泌体lnc RNA在癌与癌旁组织的差异表达;（9）在细胞水平验证外泌体lnc RNA在CRC中的功能;（10）建立外泌体competing endogenous RNA（ce RNA）网络,探索外泌体靶基因的生物学功能。【研究结果】（1）本研究共纳入1202例CRC患者,单因素Cox分析显示LODDS,CEA,CA199,CA125与预后相关（Hazard Ratio[HR]＞1,P＜0.05）。（2）根据多因素Cox回归分析和前进后退的算法筛选最佳变量和最优模型,最终本研究定义模型的公式为:风险值（risk score）=0.1129*CA199+0.1246*CEA+0.3207*CA125+0.3365*LODDS。其中LODDS对模型的贡献最大。（3）生存曲线显示在训练集和验证集中,高风险患者的预后要远远差于低风险患者。在训练集中,该模型预测患者的1年,3年和5年总体生存期的AUC值分别为:85.0%,78.5%和76.8%。在验证集中,该模型预测的1年,3年和5年的患者的总体生存期（overall survival,OS）的area under the curve（AUC）值分别是:80.6%,77.3%和77.0%。该模型比单独指标和传统TNM分期预测的准确性高。（4）逻辑回归和生存分析DCA分析了该模型与TNM分期的临床净获益差异,结果显示该模型比TNM分期和CEA模型模型临床净获益多。亚组分析显示,无论在结肠癌还是直肠癌患者,该模型都能准确预测患者的生存情况。（5）本研究开发了一个包含LODDS,CEA,CA199和CA125的新型列线图。校正图和C-指数表明该列线图可以准确的预测患者的生存情况,具有很强的临床实用性。（6）对比5例CRC淋巴结转移和5例未转移患者的外泌体测序结果,我们发现lnc RNA CLDN23,SMIM15,SAMD11,C14orf39和SENP6在淋巴结转移组下调。（7）本研究对测序前5个差异最大的外泌体lnc RNA进行了扩大样本的验证。结果显示lnc RNA CLDN23（***P＜0.001）和lnc RNA SENP6（*P＜0.05）在结直肠癌淋巴结转移组表达下调。（8）为了进一步验证外泌体lnc RNA在结直肠癌发生发展中的作用,我们对搜集的结直肠癌组织和癌旁组织进行检测,发现该5种lnc RNA在癌组织里面都呈现下降趋势（**P＜0.01,***P＜0.001）。（9）在HCT116和SW620细胞中,CCK8显示:敲降lnc RNA CLDN23后细胞的增殖能力发生显著的上升。然而,在HCT116细胞中,促进转移基因N-cadherin无显著差异变化,而抑制转移的基因E-cadherin下调;在SW620细胞中,敲降lnc RNA CLDN23后,N-cadherin上调,而E-cadherin下调。（10）本研究依据ce RNA网络的基本理念,对lnc RNA CLDN23和SENP6进行靶mi RNA的预测,然后对mi RNA进行靶基因的预测。本研究对The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库的CRC差异基因分析,与mi RNA靶基因进行取交集,得到差异性表达的靶基因,并对其进行富集分析。在Gene Ontology（GO）富集中,差异基因主要与细胞形态发育调控,神经元突出发育调节,细胞分化调节,RAS蛋白信号转导等等相关。在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集中,差异基因主要富集在PI3K-Akt信号通路,MAPK信号通路,RAS信号通路,Hippo信号通路等等多种癌症发生发展通路。【结论】（1）在淋巴结预后方面:我们的研究对象是真实世界的结直肠癌患者,研究结果和以往很多使用公共数据库的结论是一致的。虽然这四个指标的单位不一致,是相互独立的指标但是在临床上是简单且容易获得的,可以独立预测CRC患者的总体生存期。由这四个指标组成的列线图是首次被报道,而且校正图验证其具有很稳定的较为准确的预测能力和临床实用性。（2）在术前淋巴结诊断方面:我们首次研究并确定了CRC淋巴结转移相关的外泌体lnc RNA CLDN23和SENP6,确定了其在CRC淋巴转移的临床意义,并可能作为术前肿瘤淋巴结分期的重要参考指标,从而为结直肠癌术后治疗及预后评估提供临床价值。