骨骼肌的发育是一个重要的过程,这些过程受到多种肌肉分化相关基因的调控。研究表明,外源性的营养物质也可以促进肌肉细胞分化,例如维生素、脂肪酸和氨基酸等。维生素A有维生素A1(Vitamin A1,VA1)和维生素A2两种形式,其中VA1主要存在于动物肝脏,血液和眼球的视网膜中,又称为视黄醇。VA1是一种脂溶性的醇类营养物质,对于维持骨骼正常生长发育具有重要作用。有文献报道VA1可能参与牛肌肉细胞分化。然而,关于VA1能否调控小鼠肌肉细胞分化及其分子机制尚不清楚。在此,我们主要探究VA1对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响以及其影响骨骼肌发育的分子机制。VA1通过两个连续的氧化反应产生维甲酸,维甲酸又名视黄酸(Retinoic acid,RA):首先,VA1在脱氢酶/还原酶(SDR)家族成员3(DHRS3)等酶的作用下可逆性地氧化成视黄醛(Retinaldehyde,RAL);然后RAL不可逆性地氧化成RA。DHRS3作为一种短链醇脱氢酶/还原酶超家族中高度保守的成员,是一种可逆性的酶,在VA1的代谢过程中扮演了重要的角色。然而,关于DHRS3在小鼠肌肉细胞中的表达和功能的研究报道却很罕见。本研究的主要目的:探究外源性的VA1、RAL和RA对C2C12成肌细胞分化的影响;探究DHRS3在C2C12成肌细胞分化过程中的表达规律,以及小鼠体内肌肉细胞分化过程中的表达规律;探究DHRS3的表达变化对C2C12成肌细胞分化的影响;探究VA1促进C2C12成肌细胞分化的机制与DHRS3的关系。主要研究结果如下:1.通过在小鼠C2C12成肌细胞的分化培养液中外源添加VA1、RAL和RA,并应用Western blotting和免疫荧光技术,研究外源添加VA1、RAL和RA对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响。结果表明,相比于各自对照,肌肉分化标志分子Myo G的表达量都明显升高,肌管融合率也明显增加,外源添加VA1、RAL和RA可在分化不同天数不同程度地影响小鼠C2C12成肌细胞分化。2.诱导小鼠C2C12成肌细胞分化,应用Western blotting和免疫荧光技术,研究DHRS3在小鼠C2C12成肌细胞分化过程中的表达规律。Western blotting结果显示,DHRS3的表达量随着C2C12成肌细胞分化天数的增加而增加。免疫荧光结果显示,DHRS3在分化的肌管中高表达,与Western blotting结果一致。3.为了进一步探究DHRS3在体内肌肉分化过程中的作用,我们构建了小鼠的肌肉损伤修复模型,应用Western blotting和免疫组化技术,研究DHRS3在体内肌肉分化过程中的表达规律。结果表明,在肌肉损伤修复的过程中,DHRS3基因的表达量在损伤的前3天逐步升高,其中第三天表达量最高,第5天后逐步下降。总之,DHRS3基因的表达随着肌肉分化的增加而增加。4.通过构建激活抑制载体、过表达载体和干扰载体,应用Western blotting和免疫荧光技术,研究DHRS3的表达变化对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响。结果显示,激活或过表达DHRS3使肌分化标志分子Myo G的表达量明显升高,并且使细胞的肌管融合率显著增加;抑制或干扰DHRS3的表达使Myo G的表达量明显降低,并且使细胞的肌管融合率显著降低。5.通过在小鼠C2C12成肌细胞的分化培养液中外源添加VA1、RAL和RA,同时,用si RNA干扰DHRS3的表达,采用Western blotting和免疫荧光技术,研究对小鼠C2C12成肌细胞分化的作用与DHRS3表达量的关系。结果表明,当DHRS3的表达被干扰时,VA1处理组的Myo G的表达量明显降低,并且使细胞的肌管融合率明显下降。RAL和RA处理组无明显变化。我们通过进一步外源添加VA1,同时通过高效液相色谱测定RA含量,研究VA1影响小鼠C2C12成肌细胞分化的机制。结果表明,添加VA1同时干扰DHRS3的表达可抑制VA1诱导的分化,降低RA的含量。以上研究结果表明,外源添加VA1、RAL和RA对C2C12成肌细胞的分化有不同程度的促进作用。DHRS3表达增加或降低分别促进或抑制C2C12成肌细胞分化,提示了DHRS3能影响C2C12成肌细胞分化。添加VA1同时干扰DHRS3的表达可抑制VA1诱导的分化,降低RA的含量,这些数据表明VA1很可能通过DHRS3催化形成RA的途径促进C2C12成肌细胞的分化。我们的研究成果为进一步分析肌肉发育的分子机制提供了理论基础。