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第一部分ERα、ERβ和GPER在子宫内膜异位症在位和异位子宫内膜中的表达分析目的通过比较不同月经周期,不同类型内异症内膜中ERα、ERβ和GPER的表达情况,明确不同雌激素受体亚型在子宫内膜中的表达情况和与内异症的关系。方法1.收集正常月经周期子宫内膜、内异症内膜以及卵巢型内异症、深部浸润型内异症和腹壁内异症异位子宫内膜;2.免疫组织化学染色法(IHC)对收集内膜组织ERα、ERβ和GPER进行定位和定性检测。结果1.ERs在月经各周期内膜的表达:①GPER表达于细胞膜和细胞浆,多见于子宫内膜上皮细胞,间质细胞少见,于增生期表达最高,分泌期和月经期表达下降。②ERα和ERβ主要表达于细胞核,正常子宫内膜腺上皮和间质细胞均高表达ERα和ERβ,分泌期和月经期表达下降,且间质细胞下降最明显;2.GPER在内异症在位和异位子宫内膜的表达:内异症患者在位内膜中,GPER于腺上皮和间质细胞胞浆均有表达,表达量明显高于正常内膜。在三种类型内异症中,GPER表达均升高,以腹壁内异症表达最高,卵巢型内异症最低,且卵巢型内异症中,GPER主要表达在胞浆,部分细胞出现GPER入核现象。深部浸润型内异症和腹壁内异症中GPER入核现象明显,核表达甚至高于胞浆表达;3.ERα在内异症在位和异位子宫内膜的表达:内异症患者在位内膜中,ERα表达量明显高于正常内膜。在内异症中,卵巢型和深部浸润型内异症异位内膜ERα表达升高,腹壁内异症异位内膜ERα表达降低;4.ERβ在内异症在位和异位子宫内膜的表达:内异症患者在位内膜中,ERβ表达量明显高于正常内膜。在三种类型内异症中,ERβ表达均升高,且以深部浸润型最明显。结论1.子宫内膜ERα、ERβ和GPER的表达与月经周期相关,受雌激素调控;2.ERα、ERβ和GPER在不同类型异位子宫内膜表达不同,说明其分别在不同类型内异症中起着不同作用。第二部分雌激素介导GPER调控HIF-1α通路促进子宫内膜异位症在位内膜侵袭和血管生成的机制研究目的1.明确内异症在位内膜是否高表达HIF-1α蛋白及其与GPER的关系;2.研究内异症在位内膜中雌激素是否通过GPER抑制HIF-1 α的降解,维持HIF-1 α的稳定性,激活HIF-1α信号通路;3.研究HIF-1α信号通路激活后是否能促进人子宫内膜间质细胞(ESCs)侵袭转移和血管生成。方法1.IHC检测GPER和HIF-1α在正常内膜和在位内膜中的表达情况;2.正常人ESCs的分离培养和细胞鉴定;3.17β-E2和GPER特异性激活剂G1刺激ESCs,Western blot,RT-PCR检测GPER和HIF-1α的表达情况;4.提前给与GPER拮抗剂G15刺激ESCs半小时,抑制GPER的作用。再用17β-E2或G1刺激ESCs,细胞免疫荧光(IF)观察细胞内GPER定位和表达情况,Western blot,RT-PCR检测GPER和HIF-1α的表达情况,双荧光素酶法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP9)启动子荧光素酶表达情况;5.提前给与GPER拮抗剂G15刺激ESCs半小时,抑制GPER的作用。再用17β-E2或G1刺激ESCs,小管形成实验检测ESCs分泌物促血管生成能力,Transwell实验检测ESCs的侵袭能力。结果1.与正常内膜相比,在位内膜GPER和HIF-1α蛋白表达增加;2.成功分离ESCs,细胞纯度和阳性率均高于95%;3.雌激素和G1能同时促进ESCs内GPER的转录和翻译,GPER mRNA和蛋白水平均升高,但对HIF-1α转录无影响,而是通过抑制降解使HIF-1α蛋白增加,HIF-1α通路激活,促进HIF-1α下游靶基因VEGF和MMP9表达。G15能阻断这一作用;4.雌激素和G1能促进ESCs血管生成和侵袭转移能力,G15能阻断这一作用。结论雌激素介导GPER抑制HIF-1α降解,激活HIF-1α信号通路,启动HIF-1α下游靶基因VEGF、MMP9表达,促进内异症在位内膜的粘附、侵袭和血管生成。第三部分雌激素介导ERα调控Wnt/β-catenin通路促进子宫内膜异位症异位内膜侵袭和血管生成的机制研究目的1.明确卵巢型内异症中是否存在Wnt通路激活现象;2.研究Wnt通路在雌激素促进ESCs侵袭和血管生成中的作用;3.阐明内异症中雌激素是否通过ERα激活Wnt通路及其具体机制;4.阐明Wnt通路上调MMP9和VEGF促进异位内膜侵袭和血管生成的分子机制。方法1.IHC,Western blot,RT-PCR检测正常内膜、卵巢型内异症在位内膜以及异位内膜中ERα,β-catenin,VEGF和MMP9的表达情况;2.17β-E2 刺激 ESCs,IF 观察 β-catenin 表达和入核情况,Western blot,RT-PCR检测VEGF和MMP9的表达情况;3.分别构建ERα过表达载体、β-catenin过表达和沉默载体,转染ESCs,检测β-catenin、VEGF和MMP9的表达情况,检测ESCs的迁移和侵袭能力。4.构建ERα过表达载体和β-catenin启动子荧光素酶报告基因,通过双荧光素酶法和染色质免疫共沉淀法(ChIP)研究雌激素介导ERα激活Wnt/β-catenin信号通路的具体机制;5.分别构建VEGF和MMP9启动子荧光素酶报告基因,构建β-catenin过表达和沉默载体,通过双荧光素酶法和ChIP研究Wnt/β-catenin信号通路上调VEGF和MMP9表达的具体机制。结果1.与正常内膜相比,卵巢型内异症患者在位内膜和异位内膜间质细胞高表达ERα,β-catenin,VEGF 和 MMP9;2.雌激素促进β-catenin表达,诱导β-catenin入核,激活Wnt/β-catenin信号通路,上调MMP9和VEGF表达,促进内膜间质细胞迁移、侵袭和血管生成;3.ERα能作为转录因子结合到β-catenin启动子的ERE区,促进β-catenin的表达;4.β-catenin入核后与TCF3/LEF1结合,作用于VEGF和MMP9启动子的TCF3结合区,上调VEGF和MMP9的表达。结论雌激素通过受体ERα上调β-catenin表达,促进其入核,激活Wnt通路,继而β-catenin与核转录因子TCF3/LEF1结合,启动下游靶基因VEGF、MMP9,促进异位子宫内膜的粘附、侵袭和血管生成。第四部分雌激素介导ERβ调控HIF-1α通路诱导间质-上皮转化促进子宫内膜异位症异位病灶形成的机制研究目的1.明确MET在卵巢型内异症异位内膜病灶形成中的作用;2.明确ERβ和HIF-1α通路在卵巢型内异症异位内膜MET发生中的作用;3.阐明雌激素介导ERβ调控HIF-1α通路诱导卵巢型内异症MET发生的的分子机制。方法1.IHC法对卵巢型内异症患者在位和异位子宫内膜及正常子宫内膜ERβ,HIF-1α,MET标记物E-cadherin,Vimentin,以及E-cadherin转录抑制因子Twist进行表达和定位分析;2.17β-E2 刺激 ESCs,Western blot、RT-PCR 检测 ERβ,HIF-1α,MET 标记物E-cadherin,Vimentin,以及E-cadherin转录抑制因子Twist的表达;同时观察ERβ特异性拮抗剂PHTPP能否逆转其作用;3.在低氧环境下(1%氧浓度),17β-E2作用ESCs不同时间(0-7天),Westernblot、RT-PCR 检测 ERβ,HIF-1α,MET 标记物 E-cadherin,Vimentin,以及 E-cadherin转录抑制因子Twist的表达;4.17β-E2和(或)PHTTP刺激ESCs,ICC观察细胞形态的变化;Transwell方法检测ESC体外粘附、侵袭与迁移能力,克隆实验检测细胞的增殖能力;5.分别构建ERβ过表达和沉默载体,转染ESCs,检测HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表达情况;6.分别构建HIF-1α启动子荧光素酶报告基因,构建ERβ过表达和沉默载体,通过双荧光素酶法和ChIP研究ERβ抑制HIF-1a表达的具体机制。结果1.MET现象普遍存在于卵巢型内异症异位内膜组织;2.雌激素体外能明显促进ESCs内ERβ和MET相关蛋白表达,抑制HIF-1α表达,即使在低氧环境下,该刺激效果依然存在;3.ERβ特异性抑制剂PHTPP能阻断雌激素对HIF-1α的抑制作用,逆转MET过程;4.过表达ERβ,能抑制HIF-1α表达,促进EMT发生,反之,沉默ERβ则结果相反;5.ERβ能作为转录因子结合到HIF-1α启动子的ERE区,抑制HIF-1α的表达。结论雌激素通过受体ERβ抑制HIF-1α通路,HIF-1α失活导致Twist表达降低,解除了对E-cadherin的抑制,促进MET发生,参与了异位子宫内膜细胞的增殖及异位病灶的形成。