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本课题组前期应用icroRNA芯片技术筛选肝癌组织和癌旁组织差异表达microRNAs,结果显示miR-15a/16在肝癌组织中表达明显下调。为了进一步研究miR-15a/16的功能,本课题组从美国jackson实验室引进了miR-15a/16-1基因敲除小鼠。本课题拟对引进的tniR-15a/16-1基因敲除小鼠初步分析miR-15a/16-1缺失对生理状态下及荷瘤后免疫功能的影响,为抗肿瘤免疫治疗提供新的思路。研究内容分为3个部分：1.miR-15a/16-1-/-晓鼠的繁育与鉴定及8-10周龄小鼠脾脏细胞亚群频率分析目的：利用引进的nmiR-15a/16-1-/-小鼠,初步分析8～10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏细胞亚群频率。方法：首先对miR-15a/16-1-/-小鼠进行常规的交配传代及常规PCR鉴定；其次,处死小鼠后,取8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏制备成单细胞悬液,用流式细胞术分别检测脾脏中各种免疫细胞频率。另外,对8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠和对照组小鼠进行眼眶取血,用动物血液分析仪进行全血细胞分析。结果：miR-15a/16-1+/-(WT/KO)、miR-15a/16-1-/-(KO)、miR-15a/16-1+/+(WT)各表型小鼠繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律。实验所用的PCR方法可以鉴定miR-15a/16-1-/-(KO)鼠,miR-15a/16-1-/-(KO)小鼠的获得为进一步探究miR-15a/16-1的功能提供了较理想的动物模型。与同年龄miR-15a/16-1+/+(WT)小鼠比较,流式细胞术结果显示8-10周龄miR-15a/16-1-/-、鼠脾脏CD19+细胞频率增高,CD4+、CD8+、Gr-1+、NK1.1+、CD11c+、F4/80+细胞频率无明显变化。动物血液分析仪分析结果显示8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠淋巴细胞增多,其余无明显变化。结论：8-10周龄]miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+细胞频率增多。2.观察不同年龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+细胞的表型和功能目的：确定不同年龄txaR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+细胞的表型和功能。方法：首先取8-10周龄和8-12月龄txaR-15a/16-1-/-小鼠脾脏制备成单细胞悬液,流式细胞术分别检测脾脏B220+CD19+细胞亚群频率；用CD19磁珠分选出CD19+细胞,LPS刺激0 h、24 h、48 h后收集上清,用ELISA法检测上清中IL-10的浓度；其次,取制备好的8-12月龄nmiR-15a/16-1-/-小鼠脾脏单细胞悬液,流式细胞术胞内染色法检测小鼠脾脏CD19+细胞内IL-10的表达；取8-10周龄和8-12月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏制备成单细胞悬液,流式细胞术分别检测脾脏CD19+Tim-1+, CD19hiFcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞亚群频率及用胞内染色法检测CD19+Tim-1+细胞内IL-10的表达；最后,用H22细胞给8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠荷瘤,流式细胞术检测脾脏CD19+Tim-1+细胞亚群频率。结果：与同年龄miR-15a/16-1+/+(WT)、鼠比较,8-10周龄niR-15a/16-1-/-(KO)、鼠脾脏B220+CD19+细胞亚群频率轻度增高,8-12月龄niR-15a/16-1-/-(KO)、鼠脾脏B220+CD19+细胞亚群频率明显增高；8-12月龄miR-15a/16-1-/-(KO)小鼠脾脏CD19+细胞高分泌IL-10。8-12月龄miR-15a/16-1-/-(KO)小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞频率增多,且这群细胞能分泌IL-10。与同年龄miR-15a/16-1+/+(WT)荷瘤小鼠比较,8-10周龄wR-l5a/16-1-/-小鼠荷瘤后,其脾脏CD19+Tim-1+细胞亚群频率轻度增多。结论：8-12月龄miR-15a/16-1-/-(KO)小鼠脾脏CD19+细胞分泌IL-10明显增多,初步证实其表型为CD19+Tim-1+。3.分析8-10周龄aiR-15a/16-1-/-小鼠T细胞活性及其介导的肿瘤免疫功能目的：观察nR-15a/16-1对8-10周龄小鼠荷瘤后肿瘤免疫功能的影响方法：首先取8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏制备成单细胞悬液,流式细胞术检测生理状态下小鼠脾脏T细胞相关表面受体表达;其次,给8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠及同品系C57BL6小鼠左侧腋窝下接种H22肝癌细胞株,成瘤第7天起,到14天后荷瘤结束,观察各组小鼠生存状况,期间每天用游标卡尺认真测量荷瘤小鼠的肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线。在荷瘤第14天处死小鼠,肉眼观察各实验组小鼠取出肿瘤的大体形态。取部分荷瘤小鼠移植瘤用中性福尔马林固定,用于荷瘤小鼠肿瘤组织形态学观察。剩余部分制成肿瘤组织单细胞悬液,同时,将小鼠脾脏制成单细胞悬液,流式细胞术检测并分析小鼠脾脏和肿瘤组织中CD8+、CD4+细胞及CD8+NKG2D+、CD4+NKG2D+细胞亚群频率。结果：生理状态下,8-10周龄niR-158/16-/-(KO)、鼠与同品系同周龄小鼠比较,脾脏CD8+NKG2D+细胞亚群频率明显增多,CD4+NKG2 D+细胞亚群频率轻度增多；荷瘤后发现与同品系对照荷瘤小鼠相比,8-10周龄aiR-15a/16-1-/-小鼠移植瘤生长速度减慢：HE染色提示两者肿瘤组织病理变化无明显差异；8-10周龄miR-15a/16-1-/-(KO)小鼠,与同品系同周龄小鼠比较,脾脏单细胞悬液中CD8+、CD4+细胞及CD8+NKG2D+、CD4+NKG2 D+细胞亚群频率无明显改变,而肿瘤组织单细胞悬液中,CD8+细胞及CD8+NKG2D+细胞亚群频率轻度增高,CD4+细胞及CD4+NKG2D+细胞亚群频率无明显改变。结论：与同背景同品系对照小鼠相比,8-10周龄miR-15a/16-1-/-小鼠移植瘤生长速度减慢,其肿瘤组织内CD8+NKG2D+细胞的频率增高。