乳腺癌发病率和死亡率已跃居全球女性恶性肿瘤的首位。与欧美等发达国家相比,中国等发展中国家的乳腺癌发病表现出发病率较低、患者较年轻、激素受体阴性比例较高等特点。然而,有关中国乳腺癌临床病理特征的研究,主要集中于沿海发达地区,缺乏单独研究中国中部欠发达地区乳腺癌临床病理特征的报道。现代肿瘤学研究已证实,癌细胞的无限增殖,进而导致肿瘤细胞的侵袭转移,是肿瘤进展和患者死亡的主要原因。Ki67抗原是一种癌细胞增殖的特异性标记物,与乳腺癌的预后关系密切。但现行的人工Ki67评估法,存在技术难度高、耗时长、主观性强、观察者内和观察者间变异大等问题,严重限制了其在临床中的推广和应用。计算机图像识别(Computer image recognition, CIR)技术可快速、客观地提取组织图像中的高通量信息,并对其加以系统性分析,客观、高效地评估Ki67表达,有效克服人工方法的缺点。但传统Ki67免疫组织化学(Immunohistological, IHC)染色图像,存在图像对比度差、纹理复杂、背景干扰多等缺点,CIR技术难以仅根据IHC图像中细胞核的颜色、形状、大小等特征,来识别癌细胞、间质细胞和Ki67阳性癌细胞等,并进行Ki67评估和解读。因此,开发针对乳腺癌组织中多种成分的新型成像技术,优化计算机的图像识别与分析方法,是建立Ki67评估系统的重大前提。量子点(Quantum dots, QDs)是一种新型荧光纳米材料,其具有荧光强度高、抗光漂性强、激发光谱宽、发射光谱窄且可调节、一元激发多元发射等多种优良光学性能,可对多个靶标分子信息进行原位、实时共成像,研究多分子之间的协同表达、时空关系和交互作用。作为一种新型成像技术,多光谱成像技术兼具光谱探测和成像的技术优势,可将黑白成像或色彩精度不高的红绿蓝成像,转化为色彩维度较高的光谱成像,并可将靶标光谱分离成单独的图像,消除各靶标信息之间的干扰,提高图像的信噪比、颜色分辨力和清晰度,实现多靶标信息的成像和分析。本研究面向乳腺癌这一重大社会问题,在分析乳腺癌临床病理特征的基础上,针对乳腺癌Ki67评估中存在的难题,拟采用QDs多分子成像技术,联合多光谱软件分析技术,标记并获取乳腺癌组织中Ki67抗原表达相关多靶标分子的多维光谱信息,开发针对性的CIR技术,准确识别和分析Ki67表达相关多分子的空间分布、量化关系和交互表达信息,进而建立乳腺癌Ki67综合评估体系。本课题主要包括以下四个部分：第一部分：武汉市三家三甲医院2525例乳腺癌患者的临床病理特征分析目的：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤。分析乳腺癌的临床病理特征,对乳腺癌的筛查和诊疗具有重要意义。本文旨在分析探讨武汉市三家三甲医院乳腺癌患者的临床病理特征,为乳腺癌筛查和诊疗决策提供帮助。方法：收集武汉地区三家三甲医院乳腺癌患者的临床病理资料,分析患者的年龄分布、手术方式、病理类型、TNM分期、激素受体状态等参数,探讨中国武汉及周边地区乳腺癌的临床病理特征。结果：从1995年1月至2012年12月,共收集2,525例乳腺癌的临床病理资料。分析发现,乳腺癌发病中位年龄为50岁,峰值年龄为45-49岁。改良根治术、根治术、保乳术和单纯切除术的比例分别为71.8%(1,812/2,525)、18.0%(454/2,525)、5.2%(131/2,525)和2.6%(66/2,525)；与其它年龄组相比,≤ 44岁年龄组中保乳手术比例(68/132,51.5%)和≥60岁年龄组中单纯切除手术的比例(57/89,64.0%),高于其它年龄组中相应手术的比例。浸润性导管癌(Invasive ductal carcinoma, IDC)为最常见的病理类型(81.0%,1,982/2,446)。TNM分期为0-Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者比例分别为28.0%(682/2,441)、48.4%(1,180/2,441)和23.7%(578/2,441)；NO患者的比例为54.5%(1,345/2,471),且其比例由30-39岁年龄组的51.1%(157/307)上升到≥70岁年龄组的64.3%(110/171),每个年龄组平均上升比例为3.3%(P=0.029)；雌激素受体阳性乳腺癌患者比例为53.0%(1,107/2,112)。与发达地区相比显示,本研究中乳腺癌呈现出患病年龄较早、保乳手术比例较低、淋巴结阴性和雌激素受体阴性比例较高等特征。结论：与发达国家和地区相比,本研究中武汉市三家三甲医院的乳腺癌患者呈现发病年龄较早、保乳手术比例较低、淋巴结阴性比例和雌激素受体阴性比例较高等特征。NO乳腺癌已成为乳腺癌发病主体,需开发新型分级系统来更准确地指导乳腺癌的分级。乳腺IDC应是将来乳腺癌研究的重点。第二部分：计算机图像识别技术研究乳腺浸润性导管癌癌巢形态学参数及其预后意义目的：癌巢的侵袭行为是乳腺IDC恶性生物学行为过程的主要体现。本文旨在建立一种基于计算机的图像识别和分析技术,研究癌巢的形态特征与乳腺癌预后之间的关系。方法：通过免疫组织化学(Immunohistochemical, IHC)方法,染色细胞角蛋白(Cytokeratin, CK),特异性标记乳腺癌癌巢,开发CIR技术,自动识别和提取肿瘤IHC染色图像中乳腺IDC癌巢的形态学参数,研究癌巢参数和患者无病生存期(Disease free survival, DFS)之间的关系。结果：本研究中开发的CIR方法,成功提取了癌巢的8个形态学参数。Kaplan-Meier分析显示其中7个形态学参数与患者DFS相关。受试者工作曲线(Receiver operating characteristic curve, ROC)分析显示,3个形态学参数(离散度、圆形度和总周长)的曲线下面积(Area under the curve, AUC)>0.5,4个形态学参数(平均面积、平均周长、总面积／总周长、平均(面积／周长))的AUC<0.5。我们将上述3个预后负相关形态学参数和4个预后正相关形态学参数分别组合成整合参数1和整合参数2。多因素分析显示,整合参数1是患者DFS的独立预后因子,且整合参数1的风险比(Hasard ratio, HR)为1.454 (95%CI[1.017-2.078]),高于N分期(HR 1.396,95% CI [1.125-1.733])和激素受体状态(HR0.575,95%CI[0.353-0.936]),但低于组织学分级(}IR 3.370,95% CI [1.125-5.364])和T分期(HR 1.610,95% CI [1.026-2.527]).结论：本研究显示,CIR技术可准确快速提取和分析癌巢的形态学参数,有助于预测无淋巴结转移乳腺癌患者的预后信息。第三部分：基于量子点多光谱成像技术优化评估乳腺癌Ki67表达及其预后意义目的：作为癌细胞增殖标志物,Ki67对乳腺癌预后具有重要影响。IHC染色的人工评估方法是当前Ki67评估的标准方法,但该方法存在很多分析变异,严重限制了其临床使用。本研究旨在建立一个基于量子点(Quantum dots, QDs)的定量多光谱成像技术,评估Ki67的表达及其在乳腺癌中的预后意义。方法：构建含240例乳腺癌组织的TMAs的芯片,建立基于QDs的多光谱成像技术,将乳腺癌组织中癌细胞核Ki67染为红色信号,将癌细胞质染为绿色信号。使用专业的光谱分析软件,分离和定量Ki67和CK,评估Ki67总量和Ki67/CK比值的预后价值。结果：QDs多光谱成像技术对Ki67和CK的成像对比度高,图像清晰,适合信号的分离和定量。通过多光谱软件获取Ki67荧光信号总量和CK荧光信号总量,并计算出Ki67/CK比值。基于最佳P值原理,用X-tile软件将Ki67总量和Ki67/CK比值分别划分为两个等级。多因素分析显示,Ki67分级(P=0.047)和Ki67/CK分级(P=0.004)均是独立的预后因子。而且,在预测复发风险效能方面,ROC分析中Ki67/CK分级的AUC(AUC:0.683,95%CI:0.613-0.752)高于Ki67分级(AUC:0.665,95%CI:0.596-0.734)和 HER2基因(AUC:0.586,95%CI:0.510-0.661),但是低于N分期(AUC:0.760,95%CI: 0.696-0.823)和组织学分级(AUC:0.756,95%CI:0.692-0.820)。结论：本研究建立的针对Ki67和CK的QDs定量和原位多光谱成像技术,可提高乳腺癌Ki67评估效能,通过预后分析证实,Ki67/CK比值的预后预测价值较Ki67总量更高。第四部分：多光谱成像结合计算机图像识别技术建立自动化评估肿瘤Ki67指数的方法目的：Ki67是一个广泛使用的肿瘤细胞增殖标志物,对乳腺癌的预后预测具有重要影响。然而,由于存在较大分析变异,病理学家难以基于IHC染色法,手动评估Ki67指数。本研究旨在通过基于QDs和有机染料的多光谱成像技术,开发新型CIR方法,自动计数乳腺癌Ki67指数。方法：建立QDs双色成像和有机染料成像的多光谱成像技术,分别用QDs-655、 QDs-585和4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),将核抗原Ki67、肿瘤细胞浆CK和细胞核分别标记为红色、黄色和蓝色三种颜色。使用CRi Nuance光谱分析软件,采集并分离Ki67、CK和DAPI的信号。开发CIR技术,识别上述三个指标,建立基于多光谱成像的Ki67评估方法,自动化评估Ki67指数。通过比较患者的计算机Ki67指数、视觉Ki67指数和标记Ki67指数,评价它们的Ki67计数效能。结果：本研究开发的计算机自动化Ki67计数法,可准确有效识别和计数黄色肿瘤胞浆组织内的红色Ki67阳性肿瘤细胞核和蓝色DAPI肿瘤细胞核。通过对30例患者(Ki67≤10%：低分级,10%<Ki67<50%：中分级和Ki67≥50%：高分级)的90张图片计算机Ki67指数、视觉Ki67指数和标记Ki67指数之间的比较显示,计算机Ki67指数的计数准确性较视觉Ki67指数要好,特别是Ki67低分级和中分级的乳腺癌标本。结论：基于QDs和有机染料的多光谱成像技术对乳腺癌组织的成像,本研究成功开发了CIR技术,成功建立了一种计算机Ki67计数法,该方法可准确客观地自动化计数Ki67指数,有助于肿瘤预后相关分子的自动化诊断和分析。