目的:目前,蛋白质药物在肿瘤的治疗中发挥着越来越重要的作用。然而,由于其入胞效率相对较差,治疗效果受到一定影响。细胞穿膜肽(CPP)因其具有良好穿膜和携载能力为提高蛋白质药物入胞效率提供了一个有效途径。而为了克服CPP细胞选择性差的局限性,本课题利用基质金属蛋白酶(MMPs)与肿瘤的密切相关性,构建了MMP响应的可激活穿膜肽(Activatable Cell-Penetrating Peptides,ACPPs)介导的蛋白质药物胞内递送系统,其能使CPP的跨膜功能在到达肿瘤部位时选择性开启,从而介导所携载的药物入胞并发挥抗肿瘤药效。然而,由于MMPs家族内部各成员之间的高同源性导致的底物交叉活性问题,MMPs响应的递送体系仍存在非靶区响应的现象。对此,本课题结合不同MMP的特点,开发不同的策略,对进一步提高MMPs响应的ACPP介导的蛋白质药物递送体系的特异性展开研究,以期从多个角度提高蛋白质药物递送系统靶向效率。内容:本课题结合不同MMP的特点,开发不同的策略,共构建了两个MMP特异性响应的ACPP介导的蛋白质药物胞内递送系统,系统地开展了递药系统的构建及表征,并对其体内外酶响应性、递送的有效性和靶向性进行了研究。方法:系统一:该系统为MMP-2特异性响应的蛋白质药物胞内靶向递送模型系统即探针系统。此体系通过利用空间位阻效应来提高递药系统对MMP-2响应的特异性。该递药体系主要由融合蛋白和磁性纳米粒子两部分组成,通过融合蛋白和纳米粒子的连接,将MMP-2的酶切位点设计在系统内部,由此造成的空间位阻效应使膜型的MMPs(如MT1-MMP)不能接触到该底物肽从而不能进行有效酶切,而游离的分泌型的MMPs(如MMP-2)可接触到该酶切位点并进行有效酶切,以此提高了系统对MMP-2的特异性。系统的融合蛋白部分通过E.coli原核表达体系表达并采用亲和纯化得到,并通过SDS-PAGE和Western Blot对其分子量和纯度进行表征;磁性纳米粒子的粒径和形貌则通过TEM进行了表征。同时,本研究通过荧光滴定法考察磁性纳米粒子对融合蛋白的荧光淬灭效率,以确定融合蛋白与磁性纳米粒子的最佳组装比例。组装后的系统的粒径和形貌也通过TEM进行表征。随后,本研究通过酶反应对所构建系统的酶响应性进行考察,并进一步通过细胞成像实验对该系统酶响应性和递送的有效性进行细胞水平的考察。此外,本课题还从不用角度验证了通过体系设计引入的空间位阻效应的确提高了其对MMP-2响应的特异性:一是从酶的角度,即将系统与不含跨膜结构的游离的MT1-MMP的孵育,检测系统对其的响应性是否恢复;二是从探针的角度,即通过设计一FRET探针模拟去除空间位阻效应的探针系统,并考察系统对HT-1080表达的MT1-MMP的响应性是否恢复。系统二:该系统为MT1-MMP特异性响应的蛋白质药物胞内靶向递送系统。此系统通过引入MT1-MMP特异性结合肽,利用其与MT1-MMP的高亲和力,提高系统对MT1-MMP响应的特异性。本研究主要分为两步进行:第一步首先优化了体系中的酶响应模块的特异性,即通过调整靶向肽与酶切位点之间的Linker链长,筛选响应效果最好的连接长度,并在细胞和动物水平验证了该酶响应模块对对MT1-MMP响应的特异性。第二步则是将第一步优化后的酶响应模块进行进一步完善,并构建了一个MT1-MMP特异性响应的蛋白质药物胞内靶向递送系统。该系统由酶响应模块(含MT1-MMP结合肽、Linker和MT1-MMP的酶切位点)、CPP和蛋白质药物三部分通过一步融合表达得到。本课题首先以红色荧光蛋白m Cherry作为蛋白质药物模型验证了系统对药物递送的可行性,该部分通过细胞成像成像实验进行考察。而后,课题将荧光蛋白换成与之分子量相近的药物蛋白-核糖体失活蛋白Trichosanthin,构建最终的酶响应的递药系统,通过MTT实验对该系统的抗肿瘤效果进行了考察。结果:系统一:探针系统的构建与表征:SDS-PAGE检测表明,融合蛋白的分子量大约在32 k Da,与理论计算值一致;TEM透射电镜图显示了Ni Fe2O4磁性纳米粒的粒径约为96.8±7.3 nm。荧光淬灭实验结果显示,融合蛋白与Ni Fe2O4磁性纳米粒子与融合蛋白的最佳组装比例为8.3:1.0(Ni Fe2O4磁性纳米粒子/融合蛋白,W/W),组装后的探针系统的粒径约为105.6±17.5 nm,略大于纳米粒子。酶水平考察实验表明探针系统对MMP-2显现出特异性响应。细胞摄取实验证明了由HT-1080细胞高表达的MMP-2能够有效激活探针系统。同时,课题以MT1-MMP作为对照,别从酶水平和细胞水平验证了所构建的递送系统即探针系统显示出对MMP-2的良好的特异性响应。系统二:酶响应模块的优化实验中,本课题通过调整靶向肽与酶切位点之间的Linker链长,筛选出响应效果最好的酶响应模块。基于此,本课题将含不同链长的模块设计成探针形式以便进行检测筛选。酶动力学常数检测显示,MMP的多肽底物与MT1-MMP的特异性结合肽的连接明显增强了MT1-MMP对其酶切的特异性,且当Linker长度为PEG 12时,多肽探针对MT1-MMP检测的特异性最好。体外和体内实验结果都表明,含有PEG 12 Linker的酶响应模块可以有效地靶向肿瘤部位。在完成对酶响应模块的优化后,本课题构建了一个特异性MT1-MMP响应的蛋白质药物递送系统,该系统由蛋白质药物、CPP和酶响应模块三部分组成。课题首先利用荧光蛋白m Cherry作为蛋白药物模型考察了系统递送的可行性,细胞成像实验证明了该系统能够有效的递送蛋白质药物入胞。而后,课题将荧光蛋白m Cherry替换成药物蛋白天花粉蛋白TCS进行其抗肿瘤药效研究,细胞毒实验证明该蛋白质药物递送体系对卵巢癌细胞增殖有明显的抑制作用,以上实验均证明了体系的可行性和应用性。结论:本课题结合不同MMP的特点,开发不同的策略,构建了两个MMP特异性响应的ACPP介导的蛋白质药物胞内递送系统。体内外实验结果表明,这个两个递药系统均显示出了对MMP的特异性响应,且具有良好蛋白质药物胞内靶向递送潜力。