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催乳素(Prolactin ,PRL)是由垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种多肽类激素,与生长激素(Growth hormone ,GH )和胎盘催乳素(Placental Lactogens, PLs)属于同一基因家族,几乎存在于所有脊椎动物中。催乳素具有广泛的生理功能,在禽(鸟)类, PRL是促进母禽(鸟)就巢孵卵行为和调控生殖活动的关键激素。就巢期间PRL表达量升高抑制垂体促性腺激素的分泌,能使禽类卵泡停止发育并终止产蛋。在现代养禽业中,就巢行为已成为制约禽类繁殖性能和饲养效益的重要限制因素。本研究通过克隆、表达狮头鹅PRL基因成熟区序列,制备具有生物学活性的重组PRL蛋白;并对PRL在狮头鹅就巢性中的调节作用进行了初步观察,为进一步研究PRL的生物活性及其在狮头鹅就巢、产蛋中的生理调节机制奠定了基础。(1)狮头鹅PRL基因的克隆及序列分析采用Trizol试剂从狮头鹅脑垂体中提取总RNA,RT-PCR技术扩增PRL基因序列,将其克隆至pMD18-T载体,测定其核苷酸序列并与GenBank中发布的PRL基因序列进行同源性比较。结果表明,狮头鹅PRL基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸,与四川白鹅、东北籽鹅核苷酸序列同源性达100%,与浙东白鹅比较为99.9%,氨基酸序列同源性均在99%以上。生物信息学分析发现狮头鹅与其它鹅种PRL氨基酸序列具有一个潜在信号肽剪切位点(28VTS-LP32)和一个肝素结合位点,推测狮头鹅PRL蛋白二级结构由多个α螺旋和β转角及无规卷曲构成,氨基酸序列N端70~76、95~102、150~155和207~213区段为其抗原表位优势区。(2)狮头鹅重组PRL基因的原核表达设计一对带有酶切位点的特异引物,由pMD18-T-PRL重组质粒扩增PRL成熟区片段,双酶切回收目的片段与经过同样酶切处理的pET32a(+)载体连接转化E.coliDH5α,提取重组质粒进行PCR和酶切鉴定,转化E.coli BL21 (DE3)受体菌。用IPTG 37℃于不同时间诱导表达蛋白,进行SDS-PAGE电泳及Western Blot检测。结果显示在PAGE胶及NC膜上均出现分子质量约为41KDa特异蛋白条带,表达产物为可溶性蛋白,诱导4h表达的重组PRL融合蛋白占全菌总蛋白的53.6%,可以与PRL抗体发生特异反应。不同温度下诱导4 h,发现37℃目的蛋白表达量最高。(3)重组PRL融合蛋白的纯化与抗原性鉴定取pET32-PRL表达菌体超声波裂解上清液,经Ni2+-NTA凝胶柱亲和纯化表达蛋白,用梯度浓度的咪唑溶液依次洗脱未结合蛋白,再收集PRL目的蛋白。将SDS-PAGE胶分离后的表达产物经电转移至NC膜,进行Western Blot检测,与兔抗鸡PRL-IgG和HRP标记的山羊抗兔抗体反应后,DAB显色,结果表明表达目的蛋白能与PRL抗体发生特异性结合反应,在NC膜上形成分子量大小约41KDa的特异性条带,表明PRL基因表达产物具有良好抗原性。以上结果为进一步研究PRL的生物活性及其在狮头鹅就巢、产蛋中的生理调节机制奠定了基础。(4)重组PRL对狮头鹅就巢性的影响将重组PRL蛋白与弗氏不完全佐剂混合制备抗原,采用不同剂量分组免疫就巢鹅,设置生理盐水弗氏不完全佐剂对照组。观察实验组和对照组就巢情况,定期检测各组鹅血清中PRL含量。结果表明制备的重组鹅PRL蛋白具有较强免疫原性。免疫高剂量(4mg)的PRL可以快速降低循环血液中PRL水平,在免疫初期就可以快速有效地抑制狮头鹅的就巢行为。