论文部分内容阅读
目的:通过雷公藤甲素(triptolide,TP)单一及联合顺铂(cisplatin,DDP)对ACC-M细胞中SIRT3、Cyt-C、Caspase-9表达的影响,初步探讨TP单一及联合DDP对ACC-M细胞增殖抑制及凋亡作用,为TP单一或联合DDP应用于涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)临床治疗提供实验依据。方法:ACC-M细胞复苏,置于10%胎牛血清及1%双抗的RPMI-1640培养液,37℃、5%CO2培养箱中培养,并进行传代,取对数生长期细胞用于实验。通过预实验确定药物浓度梯度,设立阴性对照组(0.1%DMSO),实验组分为TP组、DDP组及联合用药组。(1)采用CCK8法测定24h、48h、72h后(2.5、5.0、10、20、40、80、160ng/mL)TP组、(0.25、0.50、1.0、2.0、4.0μg/mL)DDP组及联合用药组细胞增殖抑制率。使用SPSS20.0软件计算TP的24h IC50值、DDP 24h IC50用于后续实验。用CompuSyn软件计算联合药物指数(Combination Index,CI),通过Chou-Talalay法判断两药联合相互作用。(2)采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法:检测24h、48h后2.5、40、160ng/mL TP对细胞凋亡作用,以24h 1/2DDP IC50为阳性对照组;并检测24h后24h IC50 TP、24h IC50 DDP及联合用药对细胞凋亡作用。(3)通过Western blot法分别检测24h IC50 TP、24h IC50 DDP及联合用药作用ACC-M细胞24h后ACC-M细胞内SIRT3、Cyt-C、Caspase-9蛋白的表达。(4)通过RNA提取,逆转录,实时荧光定量PCR检测2.5、40、160ng/mL TP作用ACC-M细胞24h、48h后SIRT3、Cyt-C、Caspase-9 mRNA表达水平。结果:(1)实验组均对ACC-M细胞增殖产生抑制(P=0.000<0.05),TP对ACC-M细胞增殖抑制作用呈时间、浓度依赖性(P=0.000<0.05);TP作用时间和浓度存在交互作用(F浓度*时间=76.09,P=0.000<0.05),不同作用浓度随着作用时间的变化影响着抑制效应;TP单独作用48h、72h后,当药物浓度达到80ng/mL时,抑制效应进入平台期(P48h=0.07>0.05,P72h=0.15>0.05);在实验浓度范围内,DPP对ACC-M细胞增殖抑制效应同样呈时间、浓度依赖性(P=0.000<0.05);SPSS20.0计算得本次实验TP 24h IC50为75.67ng/mL,DDP IC50为1.89μg/mL;联合用药组细胞增殖抑制率显著高于单一用药组(F=2489.21,P<0.05)。CompuSyn测得联合用药平均CI为0.721,故药物作用24h后,TP联合DDP具有协同抑制ACC-M细胞增殖的作用。(2)流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测结果发现,2.5ng/mLTP在用药24h、48h后对ACC-M细胞均无明显凋亡作用(P24h=0.51>0.05,P48h=0.26>0.05);而TP对ACC-M细胞凋亡作用呈浓度、时间依赖性(F浓度=2965.83,P=0.000<0.05,F时间=234.29,P=0.00<0.05);与单一用药组相比,联合用药组具有更强的诱导ACC-M细胞凋亡作用(P=0.000<0.05)。(3)Western blot检测发现3组实验组均可上调线粒体凋亡蛋白Caspase-9、Cyt-C的表达(P=0.000<0.05);TP可下调SIRT3蛋白,而DDP对SIRT3蛋白表达无影响(P=0.48>0.05);联合组上调线粒体凋亡因子Caspase-9、Cyt-C能力强于单一用药(P=0.000<0.05),但SIRT3表达水平与TP组无统计学差异(P=0.77>0.05)。(4)Real-time qPCR结果示:TP可下调SIRT3 mRNA,上调Cyt-C、Caspase-9 mRNA表达,并呈浓度、时间依赖性(P=0.000<0.05)。结论:(1)在体外实验中,TP可高效地抑制ACC-M细胞增殖,在一定浓度范围内呈时间、浓度依赖性;TP具有协同增效DDP对ACC-M细胞增殖抑制及凋亡的作用。(2)TP诱导ACC-M细胞凋亡的机制可能与其下调SIRT3介导Cyt-C/Caspase-9线粒体凋亡通路相关。(3)TP联合DDP对ACC-M细胞协同抑制作用的机制可能与上调Cyt-C、Caspase-9蛋白表达,诱导细胞凋亡有关。