第一章 建立过表达miR-155的转基因小鼠目的:运用Cre/lox P系统建立条件性过表达miR-155的转基因小鼠。方法:以pEμ-mmu-miR155质粒(含318bp的小鼠miR-155前体序列)为模板,PCR扩增318bp的miR-155的前体片段,然后定向克隆入pCAG-RLG质粒的MluⅠ和Sac Ⅰ位点间,以构建转基因载体pRm155LG,所构建的载体经酶切和测序鉴定。使用C57BL/6小鼠单细胞受精卵,采用DNA原核显微注射法制备Rm155LG转基因小鼠,借助红色荧光可视化筛选和鉴定Rm155LG转基因小鼠,并通过鼠尾提取DNA进行PCR验证。将Rm155LG转基因小鼠与不同的Cre转基因小鼠(EⅡa-Cre、Ub-Cre-ERT2和Alb-Cre)进行交配,观察Cre重组酶介导DNA重组激活下游转基因miR-155和Luc等表达。利用活体荧光成像可快速有效鉴别区分纯合子转基因小鼠。通过Rm155LG转基因小鼠与EⅡa-Cre转基因小鼠进行交配,经过多轮杂交,建立广泛过表达miR-155的转基因小鼠(命名为RL-m155转基因小鼠)。结果:1)采用DNA原核显微注射法成功获得3只Rm155LG转基因首建鼠,且外源转基因能向后代稳定遗传,且mRFP能够稳定表达;2)Rm155LG转基因小鼠的主要脏器均可见红色荧光,但不同脏器间荧光强度有差异,其中心、肾、胃、肠和睾丸mRFP表达水平较高,肝、脾、肺和胸腺mRFP表达水平较低;3)Rm155LG转基因小鼠与不同的Cre转基因小鼠(即Alb-Cre转基因小鼠、EⅡa-Cre转基因小鼠或Ub-Cre-ERT2转基因小鼠)交配所获后代中,Luc转基因的表达在Rm155LG/Alb-Cre双转基因小鼠的肝脏被特异激活,或Luc转基因的表达在Rm155LG/EⅡa-Cre双转基因小鼠和Rm155LG/Ub-Cre-ERT2双转基因小鼠上被广泛激活。可见,运用Cre/lox P系统在Rm155LG/Cre双转基因小鼠实现了 Luc转基因的肝脏特异激活或广泛的激活;4)本研究所提供的数据充分证实,活体荧光成像法是一种简单、快速、可视、准确的用来鉴别纯合的转基因小鼠的筛选工具,该方法是传统方法(即小鼠交配法和实时定量PCR法)的一种替代方式和补充。我们利用该方法简单、迅速而准确地鉴别出几种转基因小鼠(如RLG转基因小鼠、RCLG转基因小鼠、Rm17LG转基因小鼠、Rm21LG转基因小鼠和Rm155LG转基因小鼠)的纯合子,该方法的可靠性、可重复性和实用性在本研究中得到充分证实;5)利用小鼠杂交法成功获得RL-m155转基因小鼠及L-m155转基因小鼠,且外源转基因能向后代稳定遗传,同时mRFP和/或Luc能够稳定表达;6)RL-m155转基因小鼠的主要脏器(如心脏、肺、脑、肾脏、肝脏、脾脏、胸腺、胃、小肠、睾丸、胰腺等)均可见红色荧光,但不同脏器间荧光强度有差异,其中脑、心、胃、胰腺、肌肉mRFP表达水平较高,脾、白色脂肪、棕色脂肪mRFP表达水平较低。小动物活体成像仪检测Luc表达发现,除小肠、胸腺、棕色脂肪和肌肉的Luc信号较弱,其它脏器均能检测到较强的Luc信号。7)qRT-PCR结果显示,miR-155在RL-m155转基因小鼠的脑、睾丸、心脏、肝、白色脂肪、棕色脂肪和胰腺的表达均显著高于野生型小鼠。RL-m155转基因小鼠体重与野生型小鼠的比较无明显差异;RL-m155转基因小鼠棕色脂肪重量显低于野生型小鼠的,而其它脏器的质量在两者间无显著差异。结论:1)运用Cre/lox P系统建立条件性过表达miR-155的转基因小鼠(命名为Rm155LG转基因小鼠);2)首次创建了利用动物活体荧光成像法鉴别纯合子转基因小鼠的方法,该方法是一种简单、快速、可视、准确的用来鉴别纯合的转基因小鼠的筛选工具;3)利用小鼠杂交法成功创建广泛过表达miR-155的转基因小鼠,RL-m155转基因小鼠和L-m1 55转基因小鼠。第二章利用肝脏特异过表达miR-155的转基因小鼠解析miR-155在肝癌发生和肝脂代谢中的功能目的:探讨miR-155对肝癌发生和小鼠脂肪代谢的影响。方法:利用Rm155LG转基因小鼠与Alb-Cre转基因小鼠交配构建肝脏特异性过表达miR-155小鼠(Rm155LG/Alb-Cre),通过表达谱芯片和qRT-PCR比较Rm155LG/Alb-Cre小鼠与野生型小鼠肝脏组织与肿瘤发生相关基因表达变化;如凋亡、DNA损伤与修复、基因组稳定性等。另外检测小鼠血脂水平,并通过表达谱芯片和qRT-PCR比较Rm155LG/Alb-Cre小鼠与野生型小鼠肝脏组织脂质代谢相关基因表达水平的差异。结果:1)成功构建肝脏过表达miR-155的转基因小鼠(Rm155LG/Alb-Cre)。2)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝脏形态变化选取3m、6m和9m小鼠进行离体肝脏大体形态观察,Rm155LG/Alb-Cre小鼠与对照小鼠比较形态无明显差异;肝脏HE结果同样显示,两者间无明显差异。3)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝细胞增殖能力增强免疫组织化学结果显示,Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝脏Ki67阳性细胞数量显著高于对照小鼠,表明miR-155能够促进小鼠肝细胞增殖。4)miR-155于鼠肝脏过表达引起肿瘤发生相关基因表达变化;miR-155于鼠肝脏过表达造成凋亡、DNA损伤与修复、基因组稳定性等相关基因表达变化,这些生物学过程有待相关功能实验确认,并阐明相关机制。5)Rm155LG/Alb-Cre小鼠血清甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均显著低于对照小鼠。6)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝脏甘油三酯合成相关基因(Dgat2、Pcsk9、Ppap2a等)和胆固醇合成相关基因(Cnbp、Cyb5r3、Dhcr24等)的表达水平显著下调,且PPAR通路相关基因表达上调(Cyp4al4、Acaalb、Fabp2等)。结论:1)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝细胞增殖能力增强,但在观察时间范围内在小鼠肝脏上未见肝癌发生;2)miR-155于鼠肝脏过表达引起肿瘤发生相关基因表达变化,造成凋亡、DNA损伤与修复、基因组稳定性等相关基因表达变化,这些基因改变与癌前病变相关,可探讨miR-155在该事件中的作用,有利于做好肿瘤的一级预防。3)miR-155调节小鼠肝脏脂质合成与代谢,能够减低血脂水平,可探讨miR-155在调控高脂血症中的应用价值。第三章利用miR-155转基因小鼠解析miR-155对糖代谢的影响及机制目的:本章分别利用第一章创建的广泛过表达miR-155的转基因小鼠(命名为RL-m155转基因小鼠)和肝脏特异过表达miR-155的转基因小鼠(命名为Rm155LG/Alb-Cre转基因小鼠,简写为Rm155LG/Cre转基因小鼠),解析miR-155对小鼠血糖水平的影响及其机制。方法:1)比较RL-m155转基因小鼠与野生型小鼠腹腔糖耐量(GTT)、胰岛素耐量(ITT)和丙酮酸耐受试验(PTT)的差异;2)比较Rm155LG/Cre转基因小鼠与对照小鼠腹腔糖耐量(IPGTT)、胰岛素耐量(ITT)和丙酮酸耐受试验(PTT)的差异;3)观察miR-155对SZT诱导模型小鼠血糖的影响;4)利用mRNA表达谱芯片、qRT-PCR或Western blot检测miR-155转基因小鼠胰岛素作用的靶器官(肝脏、骨骼肌、白色脂肪或棕色脂肪)中糖代谢和胰岛素敏感性相关基因表达水平的变化;5)RL-m155转基因小鼠胰岛形态学观察与免疫组织化学检测。结果:1)RL-m155转基因小鼠各脏器组织miR-155转基因的表达水平小动物活体成像仪检测RL-m155转基因小鼠离体器官Luc和mRFP表达显示,在RL-m155转基因小鼠的肝、骨骼肌、白色脂肪、棕色脂肪和胰腺上均可见Luc信号;从RL-m155转基因小鼠胰腺分离出的胰岛中检测较强的mRFP表达。qRT-PCR结果显示,miR-155在RL-m155转基因小鼠肝、骨骼肌、白色脂肪、棕色脂肪、胰腺和胰岛中的表达均显著高于野生型小鼠。RL-m155转基因小鼠体重与野生型小鼠比较无明显差异;RL-m155转基因小鼠棕色脂肪质量明显低于野生型小鼠。2)雄性RL-m155转基因小鼠糖耐量和胰岛素敏感性雄性RL-m155转基因小鼠非空腹血糖、12小时空腹血糖和24小时空腹血糖均低于野生型小鼠;两组小鼠间非空腹和12小时空腹后血清胰岛素水平均无显著差异。糖耐量实验显示2月龄雄性RL-m155转基因小鼠在15 min、90 min、120 min血糖上升幅度和GTT曲线下面积均显著低于野生型小鼠,GTT后0和30 min两组血清胰岛素水平均无显著差异;5月龄雄性miR-155转基因小鼠GTT实验的结果与2月龄雄性相同。腹腔注射胰岛素后,2月龄雄性和5月龄雄性RL-m155转基因小鼠血糖下降幅度显著高于野生型小鼠;曲线下面积亦低于野生型小鼠。3)雌性RL-m155转基因小鼠糖耐量和胰岛素敏感性3月龄和5月龄雌性RL-m155转基因小鼠非空腹血糖和24小时空腹血糖均低于野生型小鼠,而12小时空腹血糖未见有显著差异;miR-155转基因小鼠与野生型小鼠比较,非空腹和12小时空腹后血清胰岛素水平均无显著差异。糖耐量显示3月龄雌性RL-m155转基因小鼠在15 min、30 min、60 min血糖上升幅度和GTT曲线下面积均显著低于野生型小鼠,GTT后0和30 min两组血清胰岛素水平均无显著差异。腹腔注射胰岛素后,3月龄和5月龄雌性RL-m155转基因小鼠血糖30 min、45 min、60min下降幅度显著高于野生型小鼠;曲线下面积亦低于野生型小鼠。4)RL-m155转基因小鼠胰岛形态和细胞增殖观察HE染色显示RL-m155转基因小鼠胰岛形态无明显变化,免疫组化显示RL-m155转基因小鼠胰岛素和胰高血糖素含量与野生型小鼠比较无明显差异。通过Brdu和Ki67染色观察胰岛细胞增值情况,RL-m155转基因小鼠与野生型小鼠比较胰岛细胞增殖无显著差异。5)RL-m155转基因小鼠丙酮酸耐量实验丙酮酸耐量实验显示,2月龄雄性、3月龄雌性和5月龄雌性RL-m155转基因小鼠血糖上升幅度和曲线下面积均低于野生型小鼠,表明RL-m155转基因小鼠葡萄糖异生低于野生型小鼠。6)大剂量STZ诱导对RL-m155转基因小鼠血糖的影响大剂量STZ诱导后,RL-m155转基因小鼠和野生型小鼠随机血糖逐渐增高,但RL-m155转基因小鼠空腹血糖水平增加幅度低于野生型小鼠,在第7 d、第21 d、第28 d、第35 d和第42 d差异显著,且血糖曲线下面积低于野生型小鼠;同时RL-m155转基因小鼠空腹血糖亦低于野生型小鼠,但两者的血清胰岛素水平无明显差异。7)小剂量STZ连续诱导对RL-m155转基因小鼠血糖的影响小剂量STZ连续诱导后,RL-m155转基因小鼠随机血糖水平增加幅度低于野生型小鼠,在第7d和第10d差异显著;且血糖曲线下面积低于野生型小鼠。此外,GTT实验结果也显示腹腔注射葡萄糖后,RL-m155转基因小鼠血糖水平增加幅度低于野生型小鼠,在第15 min、第90 min和第120 min差异显著,且血糖曲线下面积低于野生型小鼠;同时STZ诱导后的RL-m155转基因小鼠空腹血糖亦低于野生型小鼠,但两者的血清胰岛素水平无明显差异。8)miR-155转基因小鼠胰岛素敏感性和糖代谢相关基因表达变化提取胰岛素主要作用靶器官组织肝脏、脂肪和骨骼肌RNA进行qRT-PCR检测,结果显示RL-m155转基因小鼠肝脏、白色脂肪和棕色脂肪中胰岛素敏感性相关基因如 Phka1、Phkg1、PDK1、PDK4、Acss2、Cebpb 和 PTEN 等表达下降;而在肌肉中葡萄糖代谢相关基因,如Gbe1、Gys1、Gys2、Pkm2和Mdh2表达显著增加。白色脂肪、棕色脂肪和肌肉组织中葡萄糖利用的关键蛋白GLUT1均显著增高。9)肝脏特异性过表达miR-155的转基因小鼠(Rm155LG/Cre)血糖的变化2月龄和4月龄雄性肝脏特异性过表达miR-155的转基因小鼠(Rm155LG/Cre)非空腹血糖、12小时空腹血糖和24小时空腹血糖均显著低于野生型小鼠;同样雌性肝脏特异性过高表达miR-155的转基因小鼠(Rm155LG/Cre)非空腹血糖、12小时空腹血糖和24小时空腹血糖亦均低于野生型小鼠,但两组小鼠间非空腹和12小时空腹后血清胰岛素水平均无显著差异。糖耐量结果显示雄性Rm155LG/Cre小鼠血糖上升幅度和GTT曲线下面积均显著低于野生型小鼠;雌性Rm155LG/Cre小鼠GTT实验的结果与雄性的相同。腹腔注射胰岛素后,雄性和雌性Rm155LG/Cre小鼠血糖上升幅度均显著低于野生型小鼠;曲线下面积亦低于野生型小鼠。丙酮酸耐量实验显示,雄性Rm155LG/Cre小鼠血糖上升幅度和曲线下面积均低于野生型小鼠,提示其糖异生下降。qRT-PCR结果显示,与葡萄糖合成相关基因如磷酸葡糖变位酶1(phosphoglucomutase 1,Pgm1)、磷酸化酶激酶α1(phosphorylase kinase Alpha 1,Phkα1)、6 磷酸葡萄糖酶催化亚基(glucose 6 phosphatase catalytic subunit,G6PC)和丙酮酸脱氢酶激酶4(Pyruvate dehydrogenase Kinase 4;PDK4)表达水平明显下降。10)肝脏特异性过表达miR-155的转基因小鼠(Rm155LG/Cre)肝脏葡萄糖代谢相关基因的变化Rm155LG/Cre双转基因小鼠肝脏葡萄糖代谢相关基因的类比较和层次聚类分析和qRT-PCR验证,结果显示肝脏糖代谢相关基因:糖原磷酸化酶(liver glycogen phosphorylase,Pygl)、2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase 2,Pgam2)、二氢硫辛酰胺 S-乙酰转移酶(dihydrolipoamide S-acetyltransferase,Dlat)、丙酮酸去氢酶(肪胺)激酶(pyruvate dehydrogenase(lipoamide)beta,Pdhb)、磷酸甘油醛异构酶(triosephosphate isomerase 1,Tpi1)、葡萄糖激酶(glucokinase,GcK)、辅酶A合成酶短链家族2acyl-CoA synthetase short-chain family member 2 Acss2 和葡萄糖-6-磷酸酶glucose-6-phosphatase G6Pc基因表达均显著下调(Table 3-3);此外促进肝脏糖原合成基因:磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,Pck1)、核糖体蛋白 S19 结合蛋白 1(ribosomal protein S19 binding protein 1,Rps19bp1)、糖原合成酶2(glycogen synthase 2,Gys)和肝糖酵解基因苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase 2,Mdh2)等基因表达上调。通过Western-blot对Rm155LG/Cre小鼠肝脏、白色脂肪和棕色脂肪组织蛋白检测发现,miR-155靶蛋白C/EBPB、HDAC4、PTEN和SOCS1在这些Rm155LG/Cre双转基因小鼠组织中出现显著的下调(Fig.3-11),这些均是与胰岛素敏感性相关蛋白,结果表明miR-155能够影响小鼠外周组织对胰岛素的敏感性。11)体外验证miR-155对胰岛素敏感相关靶基因的调控作用选用人肝癌细胞株BEL-7402,利用慢病毒载体构建稳定表达LV-miR-155的BEL-7402细胞。qRT-PCR发现miR-155能够显著下调细胞SOCS1和SOCS3基因的表达,与小鼠体内的结果相同。结论:miR-155在调节小鼠体内血糖水平和胰岛素敏感中发挥了重要作用,miR-155可能是糖尿病防治的一个潜在靶点。