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目的缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是心血管疾病死亡的主要原因。IHD的病变基础是冠状动脉血流的减少引起心肌供血不足,其病理特征是冠状动脉管腔狭窄或堵塞。再灌注治疗(药物溶栓、经皮冠状动脉支架植入术、冠状动脉搭桥术等冠状动脉血运重建技术)在恢复心脏缺血区域的冠脉血液供应中,被认为是最有效的心脏缺血治疗方法。然而,心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是IHD治疗的主要障碍。研究发现,吸入挥发性麻醉剂七氟醚(sevoflurance,SEV)能减轻I/R损伤,具有心脏保护作用,但对SEV调节的作用机制却知之甚少。越来越多的研究表明,microRNA(miRNA)参与许多心血管疾病的发生和发展,尤其表现在IHD方面,miRNA可以调节信号传导、心肌收缩、心脏生长和形态发生等心脏功能。它们还参与调节心肌细胞凋亡,特别是miRNA参与心肌梗死(myocardial infarction,MI)和心力衰竭(heart failure,HF)等心脏疾病的发病机制。前期研究发现miRNA-874(miR-874)在I/R损伤细胞中呈高表达。在寻找miR-874的下游靶标时,我们发现miR-874对JAK2/STAT3具有调控作用。本研究基于临床SEV对心脏的保护作用,旨在探讨经SEV预处理后,miR-874靶向调控JAK2/STAT3信号通路对心肌I/R损伤的保护作用机制。方法1、临床资料收集与数据分析选择2012年1月-2015年12月在东南大学附属盐城医院行择期心脏二尖瓣瓣膜置换术的患者96例,男性56例,女性40例,年龄50-75岁,ASA分级Ⅱ-Ⅲ级。采用完全随机设计将患者分成2组:SEV吸入麻醉预处理组(SEV组,n=48)和丙泊酚(propofol,PRO)静脉麻醉对照组(PRO组,n=48)。所有患者经随机化分组,至少使用一次研究药物、且至少一次具有用药后评价数据的病例集合。麻醉维持:SEV组于麻醉诱导插管成功后开始经挥发罐吹入SEV,根据患者血压调整SEV吸入浓度1.5-2.0%;PRO组在麻醉诱导插管成功后静脉持续泵注PRO 0.05-0.2 mg/kg.h。两组患者均采用泵注维库溴铵0.05-0.1 mg/kg.h维持患者肌松,间断静脉推注舒芬太尼维持镇痛,控制总量在1-3μg/kg。在主动脉阻断,心脏灌入停跳液,心脏泵功能停止,实施全流量体外循坏(cardiopulmonary bypass,CPB)替代后,SEV组立即停止SEV吸入,改用与PRO组同样的方法静脉泵注PRO 0.05-0.2 mg/kg.h维持麻醉,PRO组则继续维持原方案。所有静脉麻醉药在CPB期间均从体外循环机器血泵中注入,两组患者维持脑电双频指数在40-60。观察T0(麻醉诱导前)、T1(CPB前)、T2(术毕即刻)、T3(回ICU后4h)这4个时间点两组患者的平均动脉压(MAP)和心率(HR)变化;同时记录这4个时间点心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP),肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的水平。记录CPB时间、主动脉阻断时间、手术时间、术中舒芬太尼的使用量以及心脏复跳情况。2、细胞与动物水平探讨SEV预处理对I/R损伤的作用及其分子机制取对数生长期的H9C2细胞以2×105/孔的密度在六孔板中接种细胞,待细胞贴壁后,去除培养基,加入SEV。通过RT-PCR技术在细胞水平上检测正常心肌细胞与I/R诱导再损伤细胞中miR-874、JAK2/STAT3的相对表达情况。在随机选择的36只小鼠中建立心肌I/R损伤的小鼠模型(I/R小鼠)。通过腹膜内注射2%戊巴比妥钠麻醉小鼠,将小鼠肢体连接到心电图(ECG)电极以监测ECG。气管插管成功后连接小动物呼吸机行机械通气,同时连接多参数麻醉气体监测仪,在出现呼气末二氧化碳(ETC02)波形后,设定通气参数:VT 5-7 ml/100g,RR 60 bpm,吸呼比1:2,调整呼气末二氧化碳压力(PETCO2)在13-15 mm Hg。打开左侧第四肋间隙,使用6-0可吸收缝线穿过左前降支冠状动脉并阻塞血管。当心电图监测显示ST段显著升高时,冠状动脉闭塞成功。30 min后,松开缝合线,使血流再次通过血管。当心电监护仪显示ST段减少时,成功建立了心肌I/R损伤模型。使用随机数表法将小鼠随机分成7组:(1)在对照组中,6只小鼠未接受任何治疗。(2)在sham组中,6只小鼠未接受模型建立,但在开胸术后用6-0非侵入性可吸收缝线缝合,通过左前降支冠状动脉而不阻塞血管。(3)在I/R组中,随机选择6只I/R小鼠而不进行任何处理。(4)在SEV组中,随机选择6只I/R小鼠。在缺血30 min后,小鼠在再灌注前吸入2.8%SEV 2 min,连续5次,然后再灌注2h。(5)在SEV+AG490组中,从I/R小鼠中随机选择6只小鼠,在再灌注前5 min,静脉内注射AG490(3μg/g)。然后对小鼠进行与SEV组相同的处理。(6)在SEV+miR-874 inhibitor中,从I/R小鼠中随机选择6只小鼠。在I/R损伤前约24 h,将miR-874 inhibitor(0.2 μl/g)注射到小鼠的心肌中并关闭胸部。然后对小鼠进行与SEV组相同的处理。(7)在SEV+miR-874 inhibitor+AG490组中,从I/R小鼠中随机选择6只小鼠,在I/R损伤前24 h心肌内注射miR-874 inhibitor(0.2μl/g)并在再灌注前5 min静脉注射AG490(3μg/g)。然后对小鼠进行与SEV组相同的处理。在建立具有心肌I/R损伤的小鼠模型后,采用SEV预处理小鼠,当miR-874和JAK2/STAT3信号通路被抑制时,探索miR-874在I/R损伤中的功能机制。TUNEL染色用于检测心肌细胞凋亡,双荧光素酶报告基因测定用于鉴定miR-874和STAT3之间的靶向关系,测定JAK2/STAT3信号传导途径和凋亡相关基因的表达。结果1、临床研究发现,SEV组和PRO组两组患者在心脏复跳、术中CPB时间、主动脉阻时间、手术时间以及舒芬太尼的使用剂量上差异无统计学意义。在术中4个时间点两组患者的MAP和HR变化无明显差异。SEV组及PRO组患者的H-FABP及cTnI水平自手术开始后至回ICU后4h逐步升高,变化差异有统计学意义。此外,在术毕即刻及回ICU后4 h这2个时间点,两组患者的H-FABP及cTnI水平变化有统计学意义,SEV组均显著低于PRO组。进一步验证SEV对I/R心肌具有保护作用。2、细胞水平研究发现,SEV预处理后,随着I/R时间的延长,I/R心肌细胞中miR-874的相对表达量逐渐下降。当miR-874的表达被激活后,可以促进I/R心肌细胞的坏死;当miR-874被抑制后,减低了 I/R心肌细胞的坏死。同样对H9C2细胞进行SEV处理,采用RT-PCR检测正常心肌细胞与I/R诱导损伤心肌细胞中JAK2/STAT3的表达水平,发现随着I/R时间的延长,I/R心肌细胞中JAK2/STAT3的相对表达量逐渐升高。被抑制的JAK2/STAT3可以促进I/R心肌细胞的凋亡与坏死,而当JAK2/STAT3被激活后,则降低I/R心肌细胞的凋亡与坏死。3、动物模型研究发现,最初在I/R小鼠中观察到miR-874上调,然后通过抑制miR-874而改善I/R小鼠的心脏功能,抑制心肌细胞凋亡(表现为Bax降低和Bcl-2增加),同时激活JAK2/STAT3信号传导途径。STAT3是miR-874的靶基因,在抑制miR-874后STAT3上调。最后,我们发现当JAK2/STAT3信号传导途径被AG490阻断后,miR-874的作用丧失。结论通过临床研究、细胞水平及动物模型研究发现,与PRO静脉麻醉相比,用SEV吸入麻醉对患者进行心肌预处理,提高了心肺功能,降低了 cTnI和H-FABP的水平,进一步验证了 SEV预处理后对心肌I/R的保护作用,并揭示SEV能抑制I/R损伤细胞中miR-874的表达,从而保护了心脏功能。研究结果表明miR-874 inhibitor在心脏I/R损伤过程中具有保护作用,在SEV预处理后,miR-874通过靶向调控JAK2/STAT3信号传导途径,激活JAK2/STAT3信号通路,减轻心脏I/R的损伤。本研究为miR-874 inhibitor可以通过JAK2/STAT3信号传导途径靶向调控STAT3来介导SEV预处理,减轻心肌I/R损伤提供了依据:即刻或早期给予吸入麻醉药可发挥心肌保护效应,这也为心肌I/R损伤开辟了新的治疗手段。