一、研究背景骨折愈合过程如果伴随感染可导致愈合明显延迟甚至骨不连发生。骨形成过程就是骨骼中的成骨细胞活性与破骨细胞活性这一相互拮抗、制约的矛盾统一体的平衡过程,其中成骨细胞的作用为合成骨基质,由间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)分化而来；破骨细胞的作用为降解骨基质,由骨髓单核巨噬细胞分化演变而成。骨折愈合过程中需要大量新的成骨细胞产生,从而加快骨质合成与钙化,增加骨的体积和密度。慢性持续性炎症可刺激骨吸收,此方面研究已较成熟。但慢性持续性炎症对骨形成过程中成骨细胞分化的影响,尤其是对间充质干细胞分化成为成骨细胞过程的影响至今却所知甚少,目前国内外尚缺乏研究,而此类研究对指导临床实践具有重要意义。核转录因子NF-kB(nuclear factor kappa B)是炎症反应中关键的转录因子,在炎症反应中扮演着举足轻重的关键角色。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)、核心结合因子(Runt-related transcription factor2,Runx2)等信号通道是控制成骨细胞分化的关键因素。因此,本课题重点研究NF-κB对成骨细胞分化过程中关键的BMP-Smad通道、Runx2信号通道的影响,并探索拮抗炎症因子活性进而有效促进成骨细胞分化的化合物,是以全新方位研究促进骨折愈合的新思路。正常的生理性炎症反应是机体的一种防御反应,对骨折愈合是有益的。但由于感染或其它因素等引起的长期慢性炎症反应,对骨折愈合是无益的。类风湿性关节炎、雌激素缺乏或者老化等病人血液中肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的表达量均有所提高；多种炎性因子,包括TNF-α、白介素(interleukin-1、6, IL-1、IL-6等)可以刺激破骨细胞分化形成。脂多糖(lipopolysacchide, LPS)或者TNF-α均能刺激成骨细胞分泌破骨细胞分化因子(receptor acti-vator nuclear factor kappa B ligand,RANKL),RANKL进而与单核巨噬细胞膜受体结合通过激活NF-κB而促进单核巨噬细胞分化形成破骨细胞。感染刺激激活破骨细胞分化发育的研究已经很多,其分子机制也已比较明确。但炎症对骨形成过程中成骨细胞分化的影响,尤其是对间充质干细胞分化成为成骨细胞过程的影响至今却所知甚少,虽然对BMP-Smad和NF-κB各自单独的信号转导通道以及他们和其他通道的关系研究很多,但对这两者之间的相互作用目前尚缺乏研究,其可能的分子机制尚属未知。炎症分为细菌性和无菌性炎症。细菌毒素(如LPS)及细胞碎片和外来物(如金属固定架和固定髓内针、钢板引入的金属颗粒等)均可刺激细胞产生很多细胞因子(如TNF-α等),进而诱导激活炎症反应相关的转录因子如NF-κB等,从而发生一系列炎症反应。NF-κB是炎症反应中关键的转录因子,它控制着很多与细胞生存与繁殖有关的基因的表达,在炎症反应中扮演着举足轻重的关键角色。NF-κB是由p65和p50两个亚单位组成的符合体,IκBα(I Kappa B alpha)通过与NF-kB结合而使其失去活性,而TNF-α、LPS等可以通过激活NF-κB抑制蛋白激酶(IκBKinase,IKK),使IκBα磷酸化并最终降解,从而释放NF-κB复合物,使其得以进入细胞核内,通过与其下游信号蛋白及其启动子的结合而激活其表达。当骨折发生时,附近骨髓中的间充质干细胞在细胞外基质和损伤部位的各种细胞因子刺激激活下发育分化成为成骨细胞。间充质干细胞分化发育形成成骨细胞的过程存在着一个复杂精密的调节体系,涉及多个骨生成有关的信号转导通道,如BMP-Smad,Runx2/Cbfa1、成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、基因启动子(Lrp5)等,其中骨特异的转录因子Runx2和Osterix作用极为关键。动物试验结果显示,敲除Runx2基因的小鼠由于没有骨的产生而不能存活,Osterix也是一样,它们是成骨细胞分化的主控制开关,作用尤其重要。Runx2和Osterix的调控有很多机制,BMP-Smad信号转导通路是其中之一,细胞外的BMP-2通过与细胞膜表面的BMP受体结合并激活受体,BMP受体位于细胞内的部分可以磷酸化激活Smad1、Smad5或Smad8,使其与Smad4结合并进入细胞核,通过对多种相关的信号转导通道(包括Runx2和Osterix)的影响,从而诱导多种骨形成有关的蛋白质活化而刺激骨形成。由于BMP-Smad、Runx2等信号通道是控制成骨细胞分化的关键因素,本课题以BMP2诱导肌源前体细胞C2C12分化形成成骨细胞为模型,研究炎症因子TNF-α对成骨细胞分化的影响及其规律、分子机制和可能的改善措施,重点研究NF-κB对成骨细胞分化过程中关键的BMP-Smad通道、Runx2信号通道的影响,并探索有效促进成骨细胞分化拮抗炎症因子活性的新措施,对今后更好的指导临床实践中骨折愈合具有极为重要的意义。二、研究目的1.研究炎症因子对成骨细胞分化的影响及其规律：炎性因子TNF-α对体外培养的成骨细胞分化的影响及其规律。2.研究炎症因子影响成骨细胞分化的分子机制：通过炎症有关的转录因子NF-κB和其超级拮抗物IκBα-SR对成骨细胞分化过程中各种信号转导机制(包括BMP-Smad通道和Runx2通道)的影响,来确定其作用途径和分子机制。3.研究NEMO结合域(NBD)多肽改善TNF-α抑制成骨细胞分化的效果。三、研究方法1.细胞培养与传代：C2C12细胞系培养于DMEM/F12培养基(含10%小牛血清)中,于5%CO2孵箱内培养,温度37℃。对照组和实验组均接种于12孔培养板上贴壁培养。2.成骨细胞分化测定--ALP染色：C2C12细胞用BMP-2(100 ng/ml)、TNF-α(5 ng/ml)处理。组织化学染色：ALP检测盒(美国Sigma公司)按常规指示ALP活性。每3天更换培养基,细胞培养7天后,用PBS磷酸盐缓冲溶液清洗细胞,用混合萘酚AS-BI碱性溶液培养和茜素红染色定性检测钙矿沉积情况。红色不可溶解的颗粒物提示ALP活性的水平；定量分析：培养3天后细胞溶解,细胞ALP活性用荧光检测试剂盒(美国Sigma公司)检测,应用4-硝基苯基磷酸二钠盐(4-nitrophenyl phosphate hexahydrate, PNPP)法依说明书检测。3.瞬时转染和基因测定：将C2C12细胞接种在12孔板内,含10%胎牛血清的DMEM培养液培养24小时之后,采用Superfect试剂(Qiagen)并依照其说明分别用1μg的12xSBE-Luc, pCMV-Smad1,pCMV-NFκB (p65)或pCMV-IκBα质粒对细胞进行瞬时转染,DNA总量由添加空白质粒均衡。细胞在无血清培养基中用BMP-2(100 ng/ml)和TNF-α(5 ng/ml)培养48小时后,用pH 7.4的PBS清洗细胞3次,RIPA溶液溶解细胞,其萤光素酶活性用荧光素酶分析系统(Promega, Madison, USA)和Victor2多能计数仪(PE, Waltham, MA)测定。用于监测标准化转染率的β-乳糖苷酶(β-gal)通过β-半乳糖苷酶的酶分析系统测定(Promega)。4.实时PCR测定(real-time PCR):将C2C12细胞接种于12孔板中培养,采用上述细胞培养方法,在培养基中分别或联合加入BMP-2(100 ng/ml)和TNF-α(5 ng/ml)进行培养。48小时后收集细胞进行检测。采用TRIzol提取液(Invitrogen公司)提取总的RNA。应用总RNA逆转录合成cDNA,进行实时定量PCR检测。鼠Smadl特殊上游引物为5-GCTTCGTGAAGGGTTGGG-3’,下游引物为5’-CGGATGAAATAGGATTGTGGGG-3’。反应条件为：50℃2分钟,95℃10分钟；然后95℃15秒,60℃30秒,共40次循环。用ABI Prism公司的7000序列检测系统软件进行结果分析。以GAPDH为内参,通过ΔΔCT方法分析基因表达结果。至少重复进行三次单独的实验。5.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting):将C2C12细胞接种于12孔板中,用10%胎牛血清培养基中培养24小时,之后用无血清培养基替代,并加入BMP-2(100 ng/ml)和／或TNF-α(5 ng/ml),分别培养1、3、6小时。细胞用RIPA缓冲液溶解。同等数量总细胞溶解产物用磷酸化的Smadl (Ser463/Ser465)抗体及β-肌动蛋白抗体(β-actin)进行SDS-PAGE和Western blotting分析。β-actin作为内参对照。6.数据统计分析：采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。计量资料计算均数±标准差(x±s)表示,多组均数比较采用单向方差分析,多组均数多重比较方差齐性采用SNK法,方差不齐时采用Tamhane’s T2法,实时PCR监测Smadl mRNA表达用重复测量方差分析。检验水准=0.05,以P<0.05为统计学差异有意义。四、研究结果1.TNF-α可明显抑制BMP-2诱导的成骨细胞分化并存在剂量-效应依赖相关性我们首次监测到TNF-α在BMP-2诱导的成骨细胞分化中的抑制作用及其剂量效应。成骨细胞分化中ALP(碱性磷酸酶)常常被用于检验成骨细胞分化的进展情况。组织化学染色检测ALP活性：C2C12用BMP-2(100 ng/ml)和／或TNF-α(5 ng/ml)培养7天后和用萘酚混合染色,AS-BI碱性溶液用茜素红染色。C2C12细胞单独用BMP-2培养证明有强有力的ALP活性。而添加TNF-α能显著降低ALP活性。荧光定量分析：C2C12细胞用BMP-2(100 ng/ml)和／或TNF-α(5 ng/ml)培养3天后,与对照组相比,BMP-2能显著增加ALP活性,而添加TNF-α后ALP活性显著降低(P<0.05)。为证明此抑制作用的剂量依赖性,C2C12细胞用不同浓度的BMP-2和TNF-α进行培养,阶梯实验提示当BMP-2浓度保持100 ng/ml时,而TNF-α浓度由0增加到10 ng/ml时,不同TNF-α浓度组ALP活性整体比较有显著性差异(F=491.104,P=0.000)。不同TNF-α浓度组间两两比较显示有统计学差异(P<0.05),当TNF-α浓度为Ong/ml时,ALP活性最大,TNF-α浓度为10ng/ml时,ALP活性最小,TNF-α浓度与ALP活性存在量效关系。当TNF-α保持在5ng/ml时,BMP-2浓度从100 ng/ml提高到300 ng/ml,不同BMP-2浓度组的ALP活性有显著性差异(F=102.024,P=0.000),多重比较结果显示不同BMP-2浓度组间比较有显著性差异(P<0.05),其中当BMP-2浓度为100ng/ml时ALP活性最小,当BMP-2浓度为300ng/ml时ALP活性最大。这些结果提示TNF-α抑制BMP-2诱导的骨再生具有剂量依赖性,且能被额外添加的BMP-2逆转。2. TNF-α和NF-κB通过阻断BMP2-Smad1通路抑制成骨细胞分化为证明TNF-α抑制成骨细胞分化的机制,研究了TNF-α和NF-κB在BMP2-Smad1通路中的作用。依次分别采用BMP-2与TNF-α下游效应物或调节基因Smad1和NF-κB、IkBa过表达来替代BMP-2与TNF-α对C2C12细胞进行处理,并且Smad1的骨诱导活性反应采用12×SBE-Luc报道基因检测。结果显示：单独或联合应用TNF-α和BMP-2成骨细胞的成骨活性有显著性差异(F=59.179,P=0.005),单独应用BMP-2可提高成骨活性,而TNF-α可抑制BMP-2对成骨细胞的成骨活性；而过表达炎性因子TNF-α的下游效应子NF-κB,则BMP-2诱导成骨的活性显著降低(P<0.05)。另外TNF-α显著降低Smadl(BMP-2的下游效应物)的诱导反应活性(P<0.05)；同样,NF-κB过表达也使Smad1的诱导活性显著降低(P<0.05)。3. TNF-α能减弱Smad1信号但并不降低其丰度本研究检测了TNF-α对Smad1的表达和磷酸化的影响。TNF-α对Smad1表达的影响：从C2C12细胞中分离出总RNA,在不同时间(30,60,120,240分钟),分别或联合应用BMP-2(100 ng/ml)与TNF-α(5 ng/ml)处理,然后进行定量RT-PCR,以GAPDH为内参。实验结果显示：所有四个组别中Smad1 cDNA丰度从30分钟到120分钟均见增加,而到240分钟则均轻微减少,但添加TNF-α后并未见显著变化。TNF-α对Smad1磷酸化的影响：C2C12细胞在不同时间(1,3,6小时)用BMP-2(100 ng/ml)与TNF-α(5 ng/ml)处理后进行Smad1磷酸化测定,对相同总蛋白含量的细胞裂解物进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting测定。一抗采用抗磷酸化的NF-κB(p65)或者磷酸化Smad1,(β-actin作为内参加样对照。结果显示：用BMP-2或TNF-α单独处理后均见磷酸化的Smad1或NF-κB(p65)的数量增加；在1、3、6小时三个时间点上,添加BMP-2与否对TNF-α诱导产生的磷酸化NF-κB含量没有明显影响。而BMP-2诱导产生的磷酸化Smad1的数量在3小时明显降低,在6小时几乎未被发现。因此,这些结果证明TNF-α能够减弱Smad1信号但并不减少Smad1丰度。4.NBD多肽能改善TNF-α对成骨细胞分化的抑制作用为了寻找具有拮抗TNF-α和NF-κB抑制成骨细胞分化作用的措施,我们试验了一个短的可渗透细胞膜并干扰NEMO与IKKβ结合的多肽--可结合NEMO结合域的NBD多肽。首先,我们验证了合成的活性NBD多肽和作为对照的突变体mNBD多肽对NF-κB的抑制作用。过表达NF-κB (p65)可激活其报导载体NF-κB-Luc活性在对照组之上,NBD多肽则能降低其活性；而IκBα过表达可抑制过表达NF-κB (p65)对NF-κB-Luc指针信号的增加,添加mNBD多肽则使其活性维持在原来水平；过表达NF-κB (p65)可增强mNBD肽对NFkB-luc.的活性(P<0.05),而过表达NF-κB (p65)对NBD肽对NF-κB-Luc指针信号无显著性增强作用(P>0.05)。证明NBD多肽具有近似IkBα抑制NF-kB的活性,而mNBD多肽无作用。继而我们试验了NBD多肽和mNBD多肽对成骨细胞分化的影响。C2C12细胞用BMP-2(100 ng/ml)和／或TNF-α(5 ng/ml)处理后,添加NBD多肽(100μmol//L)或者突变型非功能mNBD多肽(100μmol/L),组织化学染色显示NBD多肽能够阻断大部分的TNF-α诱导的ALP活性降低,而mNBD多肽则几乎不起作用。定量荧光比色分析可见TNF-α可显著抑制BMP-2诱导的ALP活性(P<0.05),而添加NBD多肽和mNBD多肽后可抑制TNF-α对BMP-2诱导的ALP活性的抑制作用(P<0.05)。进一步实验证明NBD多肽能够对抗TNF-α抑制的Smad1活性。利用Smad报导基因12xSBE-Luc监测BMP2-Smad1活性,结果可见TNF-α显著降低BMP-2活性(P<0.05),而NBD多肽和mNBD多肽使其缓和TNF-α对BMP-2活性降低作用(P<0.05)。这些结果证明NBD多肽能有效改善TNF-α对成骨细胞分化活性的抑制。五、结论在创伤骨折和类风湿性关节炎中持续性的炎症和感染的存在影响骨再生。其影响机制尚不十分清楚,阻止炎症因子抑制骨再生可能是潜在的治疗方法。实验结果显示,在C2C12细胞中TNF-α能抑制成骨细胞分化,并且TNF-α对BMP-2诱导的成骨细胞分化和其对骨诱导信号的抑制具有量效相关性。此抑制作用可能是通过阻断BMP2-Smad1信号通路而实现的。阶梯实验证实TNF-α-NF-kB信号通路可以抑制BMP2-Smad1信号通路,TNF-α能减弱Smad1活性但并不减少其丰度。本研究首次显示激活的NF-κB是通过降低Smad1的活性进而抑制成骨细胞分化。并首次证明NBD多肽能有效地改善TNF-α对成骨细胞的抑制作用。这就为寻找治疗类风湿性关节炎和创伤骨折感染和其他骨丢失性疾病的新途径提供了新的思路。