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目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是多种胃疾病的重要病因,截止目前其致病机制仍不十分清楚。近年来,随着根除治疗的广泛实施,H.pylori对抗生素的耐药性逐年增加。本研究在前期工作基础之上主要聚焦于两个方面,1.筛选鉴定与H.pylori克拉霉素(clarithromycin,CAM),左氧氟沙星(levofloxacin,LVX)和甲硝唑(metronidazole,MNZ)耐药相关基因突变位点;2.构建H.pylori感染相关胃癌差异基因ceRNA调控网络,探讨相关分子的生物学功能和预后相关性。本研究将为H.pylori感染相关耐药性与致病性的进一步深入研究提供线索和理论依据。研究方法:1.利用分子对接模拟分析本组前期研究获得的9个23S rRNA耐药相关突变位点、35个rdxA耐药相关突变位点、4个gyrA耐药相关突变位点与CAM,LVX和MNZ之间的相互作用,以明确可能的耐药相关突变位点。进一步利用自然转化方法对筛选出的部分位点进行体外验证。2.从TCGA数据库中提取有或无H.pylori感染的胃癌患者RNA表达数据,包括20例H.pylori感染和168例无H.pylori感染的胃癌患者。选取2012年至2014年之间接受胃癌切除手术的70例患者术后新鲜胃癌组织标本。利用R软件计算得出差异表达的lncRNA,miRNA和mRNA,构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络,并对差异表达的mRNA进行GO及通路富集分析,通过STRING数据库构建PPI互作网络,对差异表达的lncRNA和miRNA进行生存分析,最后利用胃癌组织标本进行qRT-PCR验证。结果:1.分子对接分析结果表明,H.pylori 23S rRNA A2143G,G1949A,C1953T,G2211T位点突变后和CAM之间的结合减弱。经进一步自然转化验证,G1949A是与CAM耐药有关的新发突变位点,并且23S上双突变菌株(G1949A和A2143G)能够提高CAM耐药浓度;与MNZ耐药相关位点的模拟分析发现,共有24个rdxA基因突变位点与抗生素结合能力减弱。进一步自然转化实验成功验证了第110位点的终止密码子突变、第58位点移码突变以及M21A突变与MNZ耐药相关;经分子对接分析,筛选出LVX耐药相关基因gyrA的突变位点主要是87,91,99和143,其中87和91位点的突变已被报道与之相关,而99和143位点为本研究的新发位点。2.通过使用TCGA数据库进行生物信息学分析,在有/无H.pylori感染胃癌的比较中我们发现了27个DElncRNA,32个DEmiRNA和257个DEmRNA,这些基因可能参与了H.pylori感染相关胃癌的调控。进一步,我们构建了由11个DElncRNA,10个DEmiRNA和219个DEmRNA组成的H.pylori阳性胃癌ceRNA网络。GO分析表明,ceRNA网络的DEmRNA的细胞功能中序列特异性DNA结合,蛋白水解过程和外泌体最为显著,“PI3K-Akt信号传导通路”是最有可能发挥作用的通路。通过蛋白互作分析获得了最有意义的功能模块,其可能参与角蛋白丝及角质化过程影响疾病的发展。生存分析结果发现,有4种DElncRNA(LINC01254,LINC01287,LINC01524,U95743.1)和4种DEmiRNA(miR-302b,miR-302a,miR-378g,miR-1286)与胃癌患者的生存有关。最后,我们利用qRT-PCR在新鲜胃癌组织中对上述lncRNA分子进行验证,结果显示,在H.pylori阳性胃癌组织中LINC01254,LINC01287,LINC01524,U95743.1的表达高于H.pylori阴性胃癌组织,与TCGA的预测结果相符。结论:1.与H.pylori CAM耐药相关的新发突变包括23S rRNA的G1949A,C1953T,G2211T,经自然转化成功验证G1949A与CAM耐药的相关性,且对A2143G突变位点耐药具有协同促进作用;与H.pylori MNZ耐药相关的rdxA基因上共有24个新发突变位点,经自然转化成功验证110、58位点和M21A位点突变能够影响MNZ的耐药性;与H.pylori LVX耐药相关的gyrA基因除87,91位点外,99,143位点突变为本研究新现的耐药相关突变位点。2.利用TCGA数据库挖掘,我们成功构建了H.pylori感染相关胃癌ceRNA调控网络,包含11个DElncRNA,10个DEmiRNA和219个DEmRNA;网络分子主要参与蛋白水解等细胞生物学功能,主要富集于PI3K-Akt等信号传导通路;调控网络中LINC01254,LINC01287,LINC01524,U95743.1分子可能与H.pylori阳性胃癌致病作用及预后相关。