论文部分内容阅读
研究背景与目的：
大部分乳腺癌患者的死亡都是由于肿瘤发生转移引起的。目前针对乳腺癌转移的治疗在一定程度上提高了患者的五年生存率，但仍需进一步完善。近年研究发现，肿瘤微环境中广泛存在的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在促进乳腺癌的侵袭转移中扮演着重要的角色，但作用机制仍未可知。
肿瘤相关巨噬细胞大致分为两类：经典激活的M1型和替代激活的M2型。M1型巨噬细胞具有抗肿瘤特性，而M2型巨噬细胞则表现促肿瘤生长转移特性。有研究表明，Wnt信号在大部分的乳腺癌患者中被激活，并与整体生存率降低有关。在包括结直肠癌和乳腺癌在内的几种肿瘤类型中，β-catenin依赖的(经典途径)Wnt信号转导通路被激活，进而促进肿瘤的发生和转移。M2型巨噬细胞促乳腺癌转移作用是否与Wnt信号活化有关是我们非常感兴趣的问题。本研究拟以乳腺癌细胞系BT549和HCC1937为模型，探讨肿瘤相关巨噬细胞和β-catenin在促进乳腺癌侵袭转移中的作用及相互作用机制，为阐述乳腺癌发生和转移机制提供新的有价值的证据。
研究方法：
1、采用免疫组化技术分析M2型巨噬细胞标记物CD163在104例乳腺癌中的表达情况及其病理意义。
2、建立UaM和M2型巨噬细胞的体外极化模型，并采用流式细胞计数和实时荧光定量PCR验证。
3、采用细胞划痕和Transwell实验检测M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响；WesternBlot和实时荧光定量PCR方法检测M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞EMT和干性标志物的影响；流式细胞计数方法检测M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞CD44+CD24-/low及ALDHhigh细胞数的影响。
4、采用WesternBlot实验检测干性相关通路蛋白表达水平的变化。
5、分别在乳腺癌细胞系BT549和HCC1937中稳定敲除β-catenin，通过流式细胞计数、Transwell检测β-catenin在M2型巨噬细胞促进乳腺癌细胞侵袭转移中的作用。
6、采用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测UaM和M2型巨噬细胞中CCL2的分泌和表达情况。
7、通过细胞划痕、Transwell、WesternBlot和实时荧光定量PCR检测在M2型巨噬细胞中加入CCR2抑制剂RS102895后乳腺癌细胞侵袭转移的变化。
8、分别在培养基中加入重组人CCL2，在M2型巨噬细胞中加入CCR2抑制剂RS102895和P-AKT抑制剂LY294002，通过WesternBlot、IF实验检测M2型巨噬细胞促进乳腺癌细胞侵袭转移的具体机制。
9、分别在乳腺癌细胞系BT549和HCC1937中稳定过表达β-catenin，通过Transwell、CHIP实验检测β-catenin在M2型巨噬细胞促进乳腺癌细胞的侵袭转移和乳腺癌细胞对TAMs募集中的作用。
结果：
1、104例乳腺癌组织免疫组化结果显示：40.9%的乳腺癌组织高表达CD163，且高表达CD163与乳腺癌的淋巴结转移相关。在三阴性乳腺癌组织中高表达的比例（68%）明显高于luminal型（26.7%）及Her2阳性（42.8%）乳腺癌组织。
2、流式细胞计数和细胞形态变化表明：我们已经成功在体外构建UaM和M2型巨噬细胞模型。
3、Transwell实验显示与M2型巨噬细胞共培养的乳腺癌细胞穿过Transwell小室的细胞数量明显比对照组增多。划痕实验显示，M2-CM处理过的乳腺癌细胞划痕的愈合速度明显比对照组加快。Westernbolt和实时荧光定量PCR实验显示M2-CM处理过的乳腺癌细胞EMT相关标志物N-CAD、VIM表达显著上调。流式细胞计数实验表明M2-CM处理过后，乳腺癌干细胞亚群CD44+CD24-/low和ALDHhigh数量相比对照组明显增加。实时荧光定量PCR实验显示M2-CM处理过后，乳腺癌干细胞标志物SOX2、Nanog相对表达量增加。
4、Westernblot和实时荧光定量PCR实验显示，M2-CM处理后乳腺癌细胞中β-catenin表达增加，并且可以活化β-catenin蛋白，激活Wnt/β-catenin信号通路，使β-catenin进入细胞核。
5、在乳腺癌细胞系中敲除β-catenin，通过M2-CM处理后相对于对照组，乳腺癌干细胞亚群CD44+CD24-/low比例明显降低，穿过Transwell小室的乳腺癌细胞数量明显减少。
6、ELISA和实时荧光定量PCR实验显示，M2型巨噬细胞中CCL2的分泌和表达远高于UaM。
7、在M2型巨噬细胞中加入CCR2抑制剂后，可以有效逆转M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞侵袭转移的促进作用，并能有效逆转β-catenin蛋白的活化。
8、在M2型巨噬细胞中加入P-AKT抑制剂后，通过Westernblot实验发现CCL2通过激活P-AKT而活化β-catenin进入细胞核内发挥作用。
9、在乳腺癌细胞系中敲除β-catenin后，相对于对照组乳腺癌细胞，CCL2的相对表达量降低。过表达β-catenin后，CCL2的相对表达量增高。
10、CHIP实验结果显示，β-catenin可以和CCL2的启动子序列结合。
11、相对于对照组细胞，敲除β-catenin后，穿过Transwell小室的UaM细胞数量明显减少，而过表达β-catenin后细胞数量则明显增加。
结论：
1、M2型巨噬细胞与乳腺癌的分子分型，淋巴结转移相关；
2、M2型巨噬细胞主要通过分泌CCL2引起AKT磷酸化促进β-catenin活化来诱导乳腺癌细胞EMT和增强干性，进而促进乳腺癌的侵袭和转移；
3、活化的β-catenin通过增强CCL2的表达和分泌，募集TAMs，进而促进乳腺癌的侵袭和转移。
大部分乳腺癌患者的死亡都是由于肿瘤发生转移引起的。目前针对乳腺癌转移的治疗在一定程度上提高了患者的五年生存率，但仍需进一步完善。近年研究发现，肿瘤微环境中广泛存在的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在促进乳腺癌的侵袭转移中扮演着重要的角色，但作用机制仍未可知。
肿瘤相关巨噬细胞大致分为两类：经典激活的M1型和替代激活的M2型。M1型巨噬细胞具有抗肿瘤特性，而M2型巨噬细胞则表现促肿瘤生长转移特性。有研究表明，Wnt信号在大部分的乳腺癌患者中被激活，并与整体生存率降低有关。在包括结直肠癌和乳腺癌在内的几种肿瘤类型中，β-catenin依赖的(经典途径)Wnt信号转导通路被激活，进而促进肿瘤的发生和转移。M2型巨噬细胞促乳腺癌转移作用是否与Wnt信号活化有关是我们非常感兴趣的问题。本研究拟以乳腺癌细胞系BT549和HCC1937为模型，探讨肿瘤相关巨噬细胞和β-catenin在促进乳腺癌侵袭转移中的作用及相互作用机制，为阐述乳腺癌发生和转移机制提供新的有价值的证据。
研究方法：
1、采用免疫组化技术分析M2型巨噬细胞标记物CD163在104例乳腺癌中的表达情况及其病理意义。
2、建立UaM和M2型巨噬细胞的体外极化模型，并采用流式细胞计数和实时荧光定量PCR验证。
3、采用细胞划痕和Transwell实验检测M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响；WesternBlot和实时荧光定量PCR方法检测M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞EMT和干性标志物的影响；流式细胞计数方法检测M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞CD44+CD24-/low及ALDHhigh细胞数的影响。
4、采用WesternBlot实验检测干性相关通路蛋白表达水平的变化。
5、分别在乳腺癌细胞系BT549和HCC1937中稳定敲除β-catenin，通过流式细胞计数、Transwell检测β-catenin在M2型巨噬细胞促进乳腺癌细胞侵袭转移中的作用。
6、采用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测UaM和M2型巨噬细胞中CCL2的分泌和表达情况。
7、通过细胞划痕、Transwell、WesternBlot和实时荧光定量PCR检测在M2型巨噬细胞中加入CCR2抑制剂RS102895后乳腺癌细胞侵袭转移的变化。
8、分别在培养基中加入重组人CCL2，在M2型巨噬细胞中加入CCR2抑制剂RS102895和P-AKT抑制剂LY294002，通过WesternBlot、IF实验检测M2型巨噬细胞促进乳腺癌细胞侵袭转移的具体机制。
9、分别在乳腺癌细胞系BT549和HCC1937中稳定过表达β-catenin，通过Transwell、CHIP实验检测β-catenin在M2型巨噬细胞促进乳腺癌细胞的侵袭转移和乳腺癌细胞对TAMs募集中的作用。
结果：
1、104例乳腺癌组织免疫组化结果显示：40.9%的乳腺癌组织高表达CD163，且高表达CD163与乳腺癌的淋巴结转移相关。在三阴性乳腺癌组织中高表达的比例（68%）明显高于luminal型（26.7%）及Her2阳性（42.8%）乳腺癌组织。
2、流式细胞计数和细胞形态变化表明：我们已经成功在体外构建UaM和M2型巨噬细胞模型。
3、Transwell实验显示与M2型巨噬细胞共培养的乳腺癌细胞穿过Transwell小室的细胞数量明显比对照组增多。划痕实验显示，M2-CM处理过的乳腺癌细胞划痕的愈合速度明显比对照组加快。Westernbolt和实时荧光定量PCR实验显示M2-CM处理过的乳腺癌细胞EMT相关标志物N-CAD、VIM表达显著上调。流式细胞计数实验表明M2-CM处理过后，乳腺癌干细胞亚群CD44+CD24-/low和ALDHhigh数量相比对照组明显增加。实时荧光定量PCR实验显示M2-CM处理过后，乳腺癌干细胞标志物SOX2、Nanog相对表达量增加。
4、Westernblot和实时荧光定量PCR实验显示，M2-CM处理后乳腺癌细胞中β-catenin表达增加，并且可以活化β-catenin蛋白，激活Wnt/β-catenin信号通路，使β-catenin进入细胞核。
5、在乳腺癌细胞系中敲除β-catenin，通过M2-CM处理后相对于对照组，乳腺癌干细胞亚群CD44+CD24-/low比例明显降低，穿过Transwell小室的乳腺癌细胞数量明显减少。
6、ELISA和实时荧光定量PCR实验显示，M2型巨噬细胞中CCL2的分泌和表达远高于UaM。
7、在M2型巨噬细胞中加入CCR2抑制剂后，可以有效逆转M2型巨噬细胞对乳腺癌细胞侵袭转移的促进作用，并能有效逆转β-catenin蛋白的活化。
8、在M2型巨噬细胞中加入P-AKT抑制剂后，通过Westernblot实验发现CCL2通过激活P-AKT而活化β-catenin进入细胞核内发挥作用。
9、在乳腺癌细胞系中敲除β-catenin后，相对于对照组乳腺癌细胞，CCL2的相对表达量降低。过表达β-catenin后，CCL2的相对表达量增高。
10、CHIP实验结果显示，β-catenin可以和CCL2的启动子序列结合。
11、相对于对照组细胞，敲除β-catenin后，穿过Transwell小室的UaM细胞数量明显减少，而过表达β-catenin后细胞数量则明显增加。
结论：
1、M2型巨噬细胞与乳腺癌的分子分型，淋巴结转移相关；
2、M2型巨噬细胞主要通过分泌CCL2引起AKT磷酸化促进β-catenin活化来诱导乳腺癌细胞EMT和增强干性，进而促进乳腺癌的侵袭和转移；
3、活化的β-catenin通过增强CCL2的表达和分泌，募集TAMs，进而促进乳腺癌的侵袭和转移。