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我国作为人口大国,确保粮食产量稳定是关系国计民生的重要问题。针对有限的土地资源,培育多抗、高产、优质的品种是确保粮食安全的根本途径。杂交育种等传统方法由于具有分子机理不清、针对性较差及选育周期较长等问题,已经逐渐难以适应日益提高的育种目标,而CRISPR/Cas9技术通过编辑植物内源基因来改良抗性、提高产量,具有高效、精准的特点。YH208(宜恢208,籼稻)具有产量高、米质好等优点,但易感稻瘟病,而携带隐性抗性的Pi21等位基因对10株稻瘟病生理小种具有抗性。DS(粳稻)具有耐寒、米质优等特点,但其株高过高、易倒伏、分蘖少,而据报道D3基因负调控分蘖和株高。为此,我们利用CRISPR/Cas9技术对YH208的Pi21和DS的D3基因进行编辑以期改良其抗性或株型;同时为进一步探究Pi21、D3的作用机制以及水稻遗传改良提供材料基础。结果如下:1、利用CRISPR/Cas9编辑Pi21基因改良YH208的抗性,前期我们筛选到一份高感穗颈瘟的恢复系YH208(宜恢208),将其与Pi21感病等位基因进行比对分析,发现在其238-247、454-468处有1bp的置换(C替换成T)以及9bp、15bp的缺失,与已报道的感病基因型都不同,因此我们推测其可能为一个新的感病等位基因。在其Pi21的第二个外显子上设计双靶位点,通过遗传转化及筛选获得了10株阳性植株,将其分为3种突变类型:1种纯合突变,2种杂合双等位突变。进一步从T1代中筛选获得20株不含转基因成分的pi21突变体;2、通过田间观察发现,pi21突变体苗期植株表现矮小,营养生长发育迟缓,从两叶一心时期从下部老叶边缘开始出现类病斑,但到花期类病斑表型则完全消失。经台盼蓝、DAB染色试验,结果表明pi21突变体叶片出现大量的过氧化氢累积及细胞死亡。进一步通过qRT-PCR检测发现,突变体的防御相关基因PR1a、PR10b及SA、JA、ETH通路相关基因WRKY45、LOX2、EIN2上调表达,表明pi21突变体中的防御反应和SA、JA、ETH表达显著增强;3、将YH208离体划伤接种46份单孢菌株,筛选到7个亲和菌株。从中选择TJ13、DZ108对温室和田间环境中培养的pi21突变体进行稻瘟病抗性接种,结果表明产生类病斑的pi21突变体增强了对稻瘟病的抗性,同时我们也对产生类病斑的pi21突变体分别进行白叶枯和纹枯病抗性鉴定,结果表明pi21突变体易感纹枯病,但不影响对白叶枯的抗性;4、通过对pi21突变体主要农艺性状的统计分析,表明pi21突变体相比野生型其米质、分蘖数和每穗实粒数不受影响,但株高、结实率受到一定影响,尤其产量上明显低于野生型;5、利用CRISPR/Cas9编辑D3基因改良DS的株型,首先将DS(粳稻)与日本晴中负调控分蘖的D3基因进行序列比对,发现序列完全一样,表明DS中的D3基因同样负调控分蘖。在DS的D3基因外显子前端设计单个靶位点进行基因编辑,从T1代中共获得了4种类型的纯合突变体,均为碱基缺失,其中d3KO#1仅缺失3bp,没有产生移码突变。进一步从T2代中筛选到51株不含转基因成分d3突变体;6、田间叶龄统计发现,d3突变体生育期相比野生型缩短1周。通过连续两代的考察发现T1代纯合株系的农艺性状能够稳定遗传到子代,除d3KO#1株系农艺性状相比野生型没有明显差异外,其他3个株系株高变矮、分蘖增多,但穗长变短、每穗实粒数变少,导致最终产量没有差异;7、对d3突变体接种稻瘟菌、白叶枯菌和纹枯菌,结果表明d3突变体相比野生型增强了对白叶枯的抗性,但易感纹枯病和稻瘟病。与野生型相比,d3突变体在接种稻瘟菌后其防御相关基因表达显著下调,稻瘟菌侵入位点过氧化氢累积减少;以上结果表明:利用CRISPR/Cas9技术编辑YH208的Pi21和DS的D3基因,pi21突变体产生类病斑并增强了对稻瘟病的抗性,d3突变体表现出分蘖数增多、株高降低使株型得到改良,并增强了对白叶枯病的抗性。此外,获得了20(pi21)和51(d3)株不含转基因成分的突变体,为进一步探究Pi21、D3的作用机制以及水稻遗传改良提供了宝贵资源。