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第一部分健康人外周血树突状细胞的体外培养及其鉴定目的：建立树突状细胞(dendritic cells,DCs)体外培养的方法。方法：取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,取贴壁细胞在含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1000U/ml.重组人白细胞介素4(rh1L-4)500U/ml完全培养基中诱导培养DCs,用倒置显微镜观察其体外培养过程中的形态特征,透射电镜分析DCs细胞内部结构,流式细胞仪检测其表型分子的表达,并对其进行鉴定。结果：经本实验体系从外周血PBMCs可诱导DCs生成量为每20ml约(1.2～3.6×106),透射电镜证实呈典型的DCs细胞形态学,用流式细胞仪检测DCs的表型分子的表达分别为FITC-CD1a49.52±5.11％、PE-HLA-DR 91.19±4.29％、FITC-CD8059.42±7.05％、PE-CD86 86.21±2.39％。结论：利用rhGM-CSF和rhIL-4可以从外周血中扩增出大量DCs,为DCs的深入研究和临床应用奠定了基础。第二部分HBV慢性感染不同状态下肝郁脾虚与肝胆湿热证患者外周血树突状细胞及其功能研究目的：观察HBV慢性感染不同状态肝郁脾虚证和肝胆湿热证患者外周血树突状细胞的功能变化,了解慢性HBV感染两证型的免疫表达特点,为中医辨证提供客观化依据,并为进一步认识HBV感染慢性化本虚实质提供参考。方法：本研究分别从HBV慢性感染不同状态经辩证属于肝郁脾虚或肝胆湿热证的患者外周血来源的PBMCs进行体外培养,以倒置显微镜和电镜观察DCs外部形态和超微结构,应用流式细胞技术检测DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86、CD1a的表达,并用ELISA试剂盒检测DCs上清液中IL-12分泌水平,采用MTT法检测其同种异体混合淋巴细胞增殖的能力以比较DCs在慢性HBV感染不同阶段两证型中的功能特点,并以10例健康人为对照组。结果经统计学处理,分析两证型间DCs各指标的差异。结果：(1)形态学观察：从慢性HBV感染患者及正常人外周血分离单个核细胞,用GM-CSF+IL-4细胞因子联合诱导培养,均可获得典型的树突状细胞,病人和正常人在细胞形态上无明显差别：(2)慢性HBV感染者DCs的表面分子、细胞因子IL-12的分泌及诱导MLR的能力明显低于正常人(P<0.05),尤以慢性HBV携带者降低更明显；(3)在免疫耐受状态(即慢性HBV携带者)下,证属肝郁脾虚者的DCs的表面分子CD86 (66.83±6.53％)、CD80(15.19±3.37％)、HLA-DR(78.40±6.68%)表达均较肝胆湿热证CD86(79.35±3.15). CD80(25.69±6.13％). HLA-DR(85.70±7.34％)低,且差异具有统计学意义(P<0.05),而CD1a差异无统计学意义(P>0.05)；证属肝郁脾虚者DCs分泌IL-12的含量及DCs刺激T细胞的反应能力均较肝胆湿热证低,但两证差异无统计学意义(P>0.05)。在免疫清除状态(即慢性乙型肝炎)下,证属肝郁脾虚者的DCs的表面分子CD86(81.22±3.39％).CD80(30.56±6.55％).CD1a(45.19±6.99％)、HLA-DR(86.26±4.91％)均较肝胆湿热证CD86(87.04±2.70％).CD80(36.60±11.79％)、CD1a(47.52±6.17％)、HLA-DR(92.66±2.51％)低,但只有CD86、HLA-DR差异有统计学意义(P<0.05),而CD80、CD1a差异无统计学意义(P>0.05)。证属肝郁脾虚者DCs分泌IL-12的含量及DCs刺激T细胞的反应能力均较肝胆湿热证低,且两证差异有统计学意义(P<0.05)。(4)在免疫耐受期和免疫清除期同属肝郁脾虚证其DCs表面分子的表达分别是CD86(66.83±6.53％)、CD80(15.19±3.3％)、CD1a(45.43±7.56％)、HLADR (78.40±6.68％);CD86(81.22±3.39％).CD80(30.56±6.55％).CD1a(45.19±6.99％)、HLA-DR(86.26±4.91％),两者比较CD86、CD80. HLADR差异具有统计学意义(P<0.05)。在免疫耐受期和免疫清除期同属肝胆湿热证其DCs的表达分别是CD86(79.35±3.14％)、CD80(25.69±6.13％)、CD1a(46.94±7.02％)、HLADR (85.70±7.34％)；CD86(87.04±2.70％)、CD80(36.60±11.79％)、CD1a(47.52±6.17％)、HLA-DR(92.66±2.51％),两者比较CD86、CD80、HLADR差异具有统计学意义(P<0.05)。在辩证同属肝郁脾虚证在免疫耐受期患者DCs分泌IL-12和DCs刺激同种异体T细胞反应能力较免疫清除期低,且两者之间差异无统计学意义(P>0.05),而辩证同属肝胆湿热证其免疫耐受期患者DCs分泌IL-12和DCs刺激同种异体T细胞反应能力较免疫清除期低,且两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论：慢性HBV感染两证型均表现为DCs存在表型缺失和功能下调,提示其细胞免疫功能均降低,肝郁脾虚型细胞免疫功能降低更明显,从而难于清除HBV,更易于HBV慢性化,因此,DCs的表型及功能检测在疾病的同一阶段可为中医辩证分型提供客观化指标,反映两证型免疫表达的特点及免疫学内涵,以期更好地为临床辨治服务；但从中医辩证角度来看,在HBV感染不同状态同属肝郁脾虚证或肝胆湿热证,其免疫学特点是否真正存在显著性差异值得进一步研究,以期更好认识乙肝证型的实质。