植物因其不可运动性导致不能主动逃避有害刺激去寻求理想的环境。这使植物只能全力忍耐环境,而不是像动物一样主动选择环境。高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长和作物产量的主要的不利因子。虽然已有许多基因工程方法培育出抗性品种,但存在明显的缺陷,即:在基因工程中,用来控制目的基因表达的启动子主要是CaMV35S启动子,该启动子虽能使目的基因过量表达,但它是无环境、组织和时间特异性的组成型表达的启动子。利用组成型表达启动子控制抗性相关基因的过量表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力,但正常环境条件下细胞内也会过量表达抗逆蛋白,这不但是一种浪费,而且正常环境下细胞内的抗逆蛋白长时间过量的积累可能妨碍植物的正常生长代谢,引起植物的形态发生改变,造成转基因植物生长发育严重停滞甚至死亡。天然植物的胁迫应答中,抗逆基因的表达是诱导调控型的。即:当受到某一环境因素的胁迫时,植物会启动这些胁迫相关基因的表达,胁迫消失时基因会关闭。这种诱导调控使基因表达的强度和胁迫的严重程度正相关,从而在一定范围内极和谐地适应环境,但存在明显的缺点是抗逆能力的有限性。因此在基因工程中不仅选择使用特定的逆境胁迫诱导型的启动子是非常必要的,更为重要是寻求高强度多胁迫信号诱导表达的调控型启动子,以适应多种恶劣的环境条件及变化,使对相关基因的多胁迫诱导调控力在原有基础上大幅度提高。目前鉴定的胁迫诱导型启动子的诱导调控能力和抗逆的能力仍不能满足植物逆境条件下的要求。本实验旨在尝试寻找更加灵敏、准确、经济、高效的多诱导调控型人工嵌合启动子,期望在尽可能不增加正常环境下植物过多负担的前提下强有力的提高其对多种逆境的抵抗能力。目前已有许多种环境胁迫诱导的相关基因及其启动子被克隆,有些启动子已被详细研究,确定了这些启动子调控功能的关键片段,鉴定了一系列与转录因子相互作用的顺式作用元件。如干旱应答元件DRE、BA应答元件ABRE、光应答元件G-box等。本实验室已经从已发表的论文中获得了RD29A、ERD1、COR15A、LTI30、KIN1五个胁迫诱导基因的启动子的关键序列,这五个启动子均含有下游多个胁迫应答元件,均受多种胁迫诱导从而调控其相关基因的表达。我们已经利用PCR方法从这五个胁迫诱导基因的启动子上分别克隆了关键序列。考虑到RD29A启动子的较高诱导活性,我们选取从RD29A启动子上的关键片段到其ATG后15bp的269bp的片段为基础,然后在其5’端连接其它类型启动子的关键片段的单体或二聚体,构建了六条人工嵌合启动子,分别为(AP表示artificial promoter,NP表示natural promoter):AP1) ERD1+KIN1+COR15A+RD29A; AP2) LTI30+ERD1+KIN1+COR15A+RD29A; AP3) ERD1+COR15A+COR15A+RD29A+RD29A; AP4) ERD1+KIN1+COR15A+RD29A+RD29A; AP5) ERD1+ERD1+COR15A+RD29A+RD29A; AP6) ERD1+KIN1+COR15A+LTI30+RD29A; NP)作为对照的RD29A全长启动子。同AP2比,AP1的5’端少了LTI30片断,二者对比观察LTI30关键片断有无和活性的关系。AP2与AP6反映LTI30位置和活性的关系。AP3、AP4、AP5均含二聚体,体现二聚体的特点,它们第二个片断种类的变化是否能引起活性的改变呢?整体对比,找出活性最强的启动子组合。我们选用含有多拷贝GUS基因的pCAMBIA3301作为植物表达载体。分别用上述六条人工构建的嵌合诱导调控型启动子和RD29A全长启动子取代pCAMBIA3301上GUS基因上游的CaMV35S启动子,调控其下游的GUS基因的表达。将七个重组表达pCAMBIA3301载体分别从大肠杆菌E.coli DH5α导入农杆菌GV3101,用花浸染法转化拟南芥,得到七个转化株系。筛选出子代纯合体,PCR鉴定,再用高盐、干旱、低温等处理,GUS活性分析鉴定各个启动子的诱导活性并相互比对,以期望得到能对多种胁迫敏感,调控能力比天然诱导调控启动子明显增加的人工嵌合启动子。从中选出合适的诱导调控功能启动子,应用于科学研究领域。