第一部分Hippo/YAP信号通路诱导骨肉瘤MPPa-PDT治疗抵抗的作用和机制研究目的:1.研究YAP基因及蛋白在骨肉瘤患者中的表达和临床预后的关系。2.探索骨肉瘤细胞对MPPa-PDT治疗抵抗的可能机制。3.探讨Hippo/YAP信号通路在骨肉瘤MPPa-PDT治疗抵抗中的作用和机制。方法:1.通过活检从重庆医科大学附属第一医院采集未接受化疗的5份骨肉瘤患者肿瘤样本和相应的癌旁组织,进行免疫组化染色（IHC）和蛋白质免疫印迹（WB）实验。本研究获得重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准,所有患者均签署了知情同意书。2.使用包含127个骨肉瘤样本的肿瘤公共数据集分析YAP基因表达和临床预后的关系。利用R2平台分析微阵列数据。使用癌症细胞系百科全书（CCLE）中的数据对不同骨肿瘤细胞系YAP m RNA和蛋白水平进行评估。使用Graph Pad Prism 8分析CCLE中获得的基础数据。3.骨肉瘤细胞系HOS,MG63,U2OS和SAOS2从中国科学院细胞库中购买获得,并在37°C的5%CO2增湿培养箱中,在含有10%胎牛血清和青/链霉素的DMEM中培养。HOS和MG63细胞用MPPa在一定浓度范围内处理20 h,同时避光,然后用PBS清洗两次。然后将培养基添加到适当的孔中,并以连续输出模式将细胞暴露于红光（630nm,40m W/cm~2）下照射120s。4.含有YAP1的慢病毒载体OE-YAP购自汉恒生物技术公司。短发夹RNA（sh RNA）序列特异性YAP1（sh YAP）购自汉恒生物科技公司,用制备慢病毒感染HOS和MG63骨肉瘤细胞,q PCR和WB被用来评估靶基因表达的变化。5.MPPa-PDT处理后12 h后行CCK-8检测骨肉瘤细胞HOS和MG63光敏剂MPPa的IC50及细胞活性。Hoechst染色检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h的凋亡形态。免疫荧光（IF）检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h YAP核转位。WB检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h凋亡标志物分子和Hippo通路关键分子。流式细胞术（FC）检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h凋亡率。结果:1.为了评估YAP在骨肉瘤患者中的表达,我们从分析GEO数据库（GSE42352）的m RNA微阵列数据开始,发现YAP低表达的骨肉瘤患者平均存活时间明显长于YAP高表达患者。YAP在骨肉瘤肿瘤组织中的表达水平也明显高于正常肌肉组织。2.当我们检测CCLE数据中的YAP m RNA和蛋白质水平时,发现HOS细胞系相对于其他骨肿瘤细胞系表现出更高水平的YAP表达。然后,我们将这些发现与HOS、MG63、U2OS和SAOS2骨肉瘤细胞系中的YAP水平进行比较,并得到了类似的结果:HOS细胞YAP蛋白表达最高。最后我们进行了WB、H＆E染色和IHC染色,证实骨肉瘤患者肿瘤组织中的YAP表达水平高于癌旁组织。3.接下来,通过CCK-8实验在体外评估MPPa-PDT处理对HOS和MG63细胞活力的影响。治疗24 h后,我们发现MPPa-PDT诱导骨肉瘤细胞活力呈剂量依赖性降低,在HOS和MG63细胞中MPPa50%抑制浓度（IC50）值分别为0.15μM和0.45μM。然后对MPPa-PDT处理的细胞进行Hoechst染色,通过荧光显微镜评估凋亡形态学变化。在MPPa-PDT处理后12 h,我们观察到骨肉瘤细胞染色质密度显著增加,核固缩、凝聚和核破裂,这些与凋亡细胞形态学一致。相反,在对照组或接受MPPa或单独光照的细胞中观察到凋亡减少。WB实验进一步显示,与其他治疗组相比,MPPa-PDT治疗后12 h促凋亡蛋白（Bax,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9和cytochrome c）水平显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低。接下来进行Annexin V/PI染色,并通过流式细胞术评估细胞凋亡率。在MPPa-PDT治疗后12 h,我们观察到对照组、MPPa和光照对照组之间的凋亡率无显著差异,而MPPa-PDT组中的凋亡率显著增加。因此,MPPa-PDT可有效诱导骨肉瘤HOS和MG63细胞的凋亡。4.为了评估MPPa-PDT在HOS和MG63细胞中诱导YAP活化的能力,我们接下来进行了WB分析,与其他三个治疗组相比,MPPa-PDT处理后12 h的p-LATS/LATS和p-YAP/YAP蛋白水平降低,同时在同一时间点CTGF和CYR61蛋白水平升高。细胞免疫荧光染色证实,在MPPa-PDT处理后12 h,YAP主要定位于细胞核,而在三个对照组中,YAP主要定位于细胞质。这些结果提示MPPa-PDT可诱导骨肉瘤细胞凋亡和YAP激活。5.为了进一步确定YAP在骨肉瘤细胞中的功能重要性,我们接下来在HOS和MG63细胞中敲减或过表达该基因,并通过WB和q PCR证实YAP表达的变化。YAP敲减或过表达也分别导致YAP下游靶蛋白（CTGF和CYR61）水平的显著减少或增加。CCK-8实验检测YAP敲减或过表达后MPPa-PDT处理的骨肉瘤细胞的活性。在12 h后,这些细胞与PDT联合使用大范围的光敏剂剂量进行治疗。这些光敏剂在随后的PDT结果中显示出与靶细胞活力相关的浓度依赖性效应。MPPa-PDT处理后12 h,骨肉瘤细胞中MPPa的50%抑制浓度（IC50）在HOS-sh NC细胞中为0.155μM,在HOS-sh YAP细胞中为0.107μM,在HOS-OE-YAP细胞中为1.766μM,在MG63-sh NC细胞中为0.448μM,在MG63-sh YAP细胞中为0.069μM,在MG63-OE-YAP细胞中为0.982μM。CCK-8实验显示YAP过表达足以抑制MPPa-PDT诱导的骨肉瘤HOS和MG63细胞凋亡,而YAP敲减增强了MPPa-PDT在这些骨肉瘤细胞系中驱动凋亡的能力。Hoechst染色和流式细胞术进一步证实了YAP在MPPa-PDT诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用。类似的,WB表明YAP敲减与MPPa-PDT诱导的Bax,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9的增加以及Bcl-2蛋白水平的降低相关,而YAP过表达则具有相反的效果。总之,这些结果表明YAP可以增强骨肉瘤细胞对MPPa-PDT的治疗抵抗。结论:1.骨肉瘤患者表现出与不良预后相关的YAP上调。2.MPPa-PDT诱导骨肉瘤细胞凋亡和YAP活化。3.YAP增强骨肉瘤细胞对MPPa-PDT治疗的抵抗。第二部分骨肉瘤MPPa-PDT通过甲羟戊酸途径激活Rho A进而驱动YAP激活的作用和机制目的:1.研究RHOA基因在骨肉瘤患者中的表达和临床预后的关系。2.探索甲羟戊酸途径在骨肉瘤细胞MPPa-PDT治疗抵抗的可能机制。3.探讨甲羟戊酸途径-Rho A-YAP信号通路在骨肉瘤MPPa-PDT治疗抵抗中的作用和机制。方法:1.使用包含127个骨肉瘤样本的肿瘤公共数据集分析YAP与RHOA在骨肉瘤样本中表达的关系及RHOA基因表达和临床预后的关系。利用R2平台分析微阵列数据。2.骨肉瘤细胞系HOS和MG63从中国科学院细胞库中购买获得,并在37°C的5%CO2增湿培养箱中,在含有10%胎牛血清和青/链霉素的DMEM中培养。HOS和MG63细胞用MPPa在一定浓度范围内处理20 h,同时避光,然后用PBS清洗两次。然后将培养基添加到适当的孔皿中,并以连续输出模式将细胞暴露于红光（630nm,40m W/cm2）下照射120s。3.含有RHOA的慢病毒载体OE-RHOA购自汉恒生物技术公司。短发夹RNA（sh RNA）序列特异性RHOA（sh RHOA）购自汉恒生物科技公司,用制备慢病毒感染HOS和MG63骨肉瘤细胞,q PCR和WB用来评估靶基因表达的变化。4.HMGCR抑制剂辛伐他丁、Rho A抑制剂CCG-1423分别处理后行CCK-8检测骨肉瘤HOS和MG63的细胞活性。WB检测敲减或过表达RHOA后ROCK2/LIMK2/Cofilin/F-actin信号通路变化,检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h活化的和总的Rho A及HMGCR蛋白变化。WB检测辛伐他丁或CCG-1423处理后骨肉瘤活化的Rho A,活化的YAP及其下游靶基因变化。结果:1.为了评估RHOA在骨肉瘤患者中的表达,我们从分析GEO数据库（GSE42352）的m RNA微阵列数据开始,发现YAP与RHOA基因表达高度正相关,RHOA低表达的骨肉瘤患者无转移存活时间明显长于RHOA高表达患者。2.接下来通过CCK-8实验在体外评估辛伐他丁或CCG-1423处理对HOS和MG63细胞活力的影响。辛伐他丁处理24 h或CCG-1423处理48 h后,我们发现辛伐他丁或CCG-1423诱导骨肉瘤细胞活力呈剂量依赖性降低。3.为了评估MPPa-PDT在HOS和MG63细胞中诱导Rho A活化的能力,我们接下来进行了WB实验,结果表明与其他三个治疗组相比,MPPa-PDT处理后12 h后总的Rho A及活化的Rho A蛋白水平均升高,HMGCR蛋白表达也升高。4.为了确定Rho A在骨肉瘤细胞中功能的重要性,我们接下来在HOS和MG63细胞中敲减或过表达该基因,并通过WB和q PCR证实RHOA表达的变化。RHOA敲减或过表达也分别导致活化的YAP及其下游靶蛋白（CTGF）水平的显著减少或增加,同时引起ROCK2/LIMK2/Cofilin/F-actin信号通路蛋白变化。5.为了进一步确定甲羟戊酸及Rho A在骨肉瘤细胞中的功能,我们接下来在HOS和MG63细胞中分别使用辛伐他丁或CCG-1423,并通过WB证实活化的Rho A及活化的YAP及其下游靶基因表达的变化。使用辛伐他丁或CCG-1423分别导致活化的Rho A,活化的YAP及其下游靶蛋白（CTGF和CYR61）水平的显著减少,而补充甲羟戊酸可以部分逆转这一现象。结论:1.骨肉瘤患者表现出与不良预后相关的RHOA上调,YAP与RHOA表达高度正相关。2.甲羟戊酸途径参与骨肉瘤对MPPa-PDT治疗抵抗。3.Rho A/ROCK2/LIMK2/Cofilin/F-actin信号轴参与YAP活性的调节。4.MPPa-PDT通过甲羟戊酸途径激活Rho A,进而激活YAP。第三部分:Rho A促进骨肉瘤细胞对MPPa-PDT治疗抵抗的作用和机制研究目的:1.探讨Rho A在骨肉瘤MPPa-PDT治疗抵抗中的作用和机制。方法:1.骨肉瘤细胞系HOS和MG63从中国科学院细胞库中购买获得,并在37°C的5%CO2增湿培养箱中,在含有10%胎牛血清和青/链霉素的DMEM中培养。HOS和MG63细胞用MPPa在一定浓度范围内处理20 h,同时避光,然后用PBS清洗两次。然后将培养基添加到适当的孔皿中,并以连续输出模式将细胞暴露于红光（630nm,40m W/cm2）下照射120s。2.含有RHOA的慢病毒载体OE-RHOA购自汉恒生物技术公司。短发夹RNA（sh RNA）序列特异性RHOA（sh RHOA）购自汉恒生物科技公司,用制备慢病毒感染HOS和MG63骨肉瘤细胞,获得稳转细胞株。3.HMGCR抑制剂辛伐他丁、甲羟戊酸、Rho A抑制剂CCG-1423分别预处理骨肉瘤细胞,WB检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h活化的YAP和总的Rho A,CTGF,CYR61蛋白变化。CCK8检测敲减或过表达RHOA后骨肉瘤细胞MPPa-PDT处理后细胞活性。4.HMGCR抑制剂辛伐他丁、甲羟戊酸、Rho A抑制剂CCG-1423分别预处理敲减或过表达RHOA的骨肉瘤细胞,Hoechst,流式细胞术,WB检测MPPa-PDT处理骨肉瘤细胞HOS和MG63后12 h凋亡形态学、凋亡率和凋亡标志物分子变化。5.通过裸鼠皮下注射骨肉瘤细胞诱导成瘤的方法,评估MPPaPDT在体内能否诱导骨肉瘤凋亡,体内验证敲减或过表达RHOA对骨肉瘤凋亡的作用;此外通过TUNEL实验检测裸鼠瘤体组织凋亡水平,免疫组化检测裸鼠骨肉瘤中cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白的表达。结果:1.为进一步确定MPPa-PDT治疗骨肉瘤细胞中Rho A激活和YAP的功能重要性,我们接下来对以下治疗组进行了WB分析:对照组、MPPa-PDT、辛伐他汀+MPPa-PDT、CCG-1423+MPPa-PDT和甲羟戊酸+辛伐他汀+MPPa-PDT组。分析结果显示,在MPPa-PDT治疗后,辛伐他汀和CCG-1423显著降低了骨肉瘤细胞Rho A、激活的YAP及下游靶基因的水平,而甲羟戊酸挽救了YAP的激活,辛伐他汀则抑制了YAP的激活。2.接下来通过CCK-8实验评估敲减或过表达RHOA对HOS和MG63细胞活力的影响。这些细胞与PDT联合使用大范围的光敏剂剂量进行治疗。这些光敏剂在随后的PDT结果中显示出与靶细胞活力相关的浓度依赖性效应。MPPa-PDT处理12 h后,MPPa在骨肉瘤细胞中的IC50分别为HOS-sh NC细胞0.158μM、HOS-sh RHOA细胞0.111μM、HOS-OE-RHOA细胞3.460μM、MG63-sh NC细胞0.456μM、MG63sh RHOA细胞0.104μM、MG63-OE-RHOA细胞0.801μM。为了观察Rho A在骨肉瘤细胞中对MPPa-PDT治疗的影响,接下来进行CCK-8检测,提示Rho A过表达足以逆转HOS和MG63细胞的凋亡,而敲减Rho A则有相反的效果。3.Hoechst染色和流式细胞术进一步证实了这一结果。Rho A抑制剂CCG-1423的应用足以挽救Rho A过表达引起的凋亡抑制。WB还显示,Rho A过表达能够部分逆转MPPa-PDT诱导的HOS和MG63细胞凋亡,而Rho A敲低则促进了凋亡,这可以从cleaved PARP、Bax和cleaved caspase-3水平的增加以及Bcl-2水平的降低中得到证明。4.与sh NC组相比,植入sh RHOA肿瘤的小鼠肿瘤生长显著降低,而OE-RHOA组小鼠肿瘤生长显著增强。对小鼠肿瘤生长的抑制作用最强的是sh RHOA组进行MPPa-PDT治疗。相比之下,MPPa-PDT治疗OE-RHOA肿瘤组的小鼠与MPPa-PDT治疗sh NC小鼠相比,肿瘤生长更强劲。5.然后对肿瘤组织切片进行TUNEL染色,以评估MPPa-PDT处理后的凋亡情况,显示不同处理组（sh RHOA、OE-RHOA、MPPa-PDT、sh RHOA/MPPa-PDT和OE-RHOA/MPPa-PDT）的凋亡指数不同。我们另外评估凋亡标记物cleaved PARP和cleaved caspase-3证实Rho A敲减和MPPa-PDT抑制骨肉瘤生长的能力。与对照组相比,sh RHOA和MPPa-PDT组中这两种凋亡标志物蛋白的水平显著增加。值得注意的是,这些凋亡蛋白表达水平在联合sh RHOA/MPPa-PDT中表达最高。结论:1.Rho A增强骨肉瘤细胞对MPPa-PDT的治疗抵抗。2.Rho A基因敲减或与MPPa-PDT联合使用足以在体内抑制骨肉瘤的生长,而Rho A基因敲减和MPPa-PDT治疗联合使用的最佳结果表明,敲减Rho GTPase可以消除MPPa-PDT治疗抵抗。