背景:细胞增殖的过程是程序性的,被严格的控制和调节,以此来确保在细胞周期中通过纺锤体运动将染色体分离到子细胞时的保真度,其中纺锤体的组装和解离是具有高度动态性和组织性的。尽管人们已经对纺锤体如何组装有了很多了解,但是如何快速且不可逆地解离纺锤体是完全未知的。另一方面,最近的研究发现表明细胞活性氧(ROS)水平可以作为调节细胞增殖的“第二信使”,而氧化还原信号是否对纺锤体运动起作用这是需要我们去研究的。在这里,我们发现了富含半胱氨酸的蛋白质CRIPT,可能是通过氧化还原感应途径控制纺锤体解离进程的关键分子。目的:主要研究内容1.CRIPT对有丝分裂进程的影响2.CRIPT在细胞内的分布3.不同CRIPT突变体对有丝分裂中纺锤体解离和染色体分离的影响4.探究与CRIPT相互作用蛋白有哪些,并且可能的作用途径5.CRIPT对肿瘤的抑制作用方法:1.通过敲除和沉默CRIPT基因,检测CRIPT蛋白的缺失对有丝分裂的影响,当恢复其表达时观察是否能消除这种影响2.运用延时显微镜记录C3Y突变载体转染的细胞有丝分裂中纺锤体的变化,了解其影响纺锤体运动的过程3.对不同位置的半胱氨酸进行突变构建突变荧光载体,转染细胞观察其对纺锤体运动的影响,进一步了解不同位置的半胱氨酸残基突变会产生什么不同的现象4.通过免疫共沉淀、GST-pull down和质谱分析等实验方法,确定与其相关的相互作用蛋白5.制作肿瘤模型,用转染了突变载体的外泌体,验证突变的蛋白是否能阻止肿瘤细胞的增殖,能否对肿瘤产生抑制作用结果:通过一系列实验分析得出CRIPT在细胞增殖的调节中起重要作用,它在分裂间期主要定位于细胞核的核仁,在分裂期时会和骨架蛋白相互作用定位于胞质内。其和骨架蛋白及CKAP1/TBCB相互作用,可能形成复合体参与纺锤体的解离。CRIPT突变体可以通过抑制有丝分裂中纺锤体的解离来使细胞停滞在中期,并且可能是以氧化还原的途径调节纺锤体的运动。通过突变体能够将细胞抑制在中期,具有和紫杉醇一样的抑癌机制,设想是否对肿瘤的增殖起抑制作用,因此通过在裸鼠上构建肿瘤模型,将转有突变质粒的外泌体注入肿瘤处,培养观察到阻止肿瘤进一步生长甚至有不同程度的坏死现象出现。从而判定CRIPT突变体蛋白可能是一种潜在的抗肿瘤药物。