【摘 要】
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近年来,禽流感对家禽业造成了严重的危害并造成了巨大的经济影响,公共卫生安全也会受到严重威胁,因此,寻找对禽流感病毒起到一定治疗效果的治疗剂显得尤为重要。本研究为探索防御素（AvBD）抗禽流感病毒的作用,选用了AvBD-5、AvBD-11进行抗H9N2型禽流感病毒（H9N2）的研究,探究其是否对治疗禽流感病有一定治疗效果。主要内容如下:1.鸡β-防御素11原核蛋白的表达按照NCBI中AvBD-11的
【基金项目】
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山西省重点研发计划（201703D221024-5,201703D211001）；
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近年来,禽流感对家禽业造成了严重的危害并造成了巨大的经济影响,公共卫生安全也会受到严重威胁,因此,寻找对禽流感病毒起到一定治疗效果的治疗剂显得尤为重要。本研究为探索防御素（AvBD）抗禽流感病毒的作用,选用了AvBD-5、AvBD-11进行抗H9N2型禽流感病毒（H9N2）的研究,探究其是否对治疗禽流感病有一定治疗效果。主要内容如下:1.鸡β-防御素11原核蛋白的表达按照NCBI中AvBD-11的c DNA序列（登录号:AY621326）设计其引物,并在引物序列中添加限制性内切酶位点Bam H I和Hind III,从鸡肾脏中提取AvBD-11的RNA并将其反转录扩增目的条带,扩增成功后送至公司测序并优化基因序列,将优化后的目的基因与Pet30a表达载体分别双酶切后进行连接,并转化进大肠杆菌Top10中,用IPTG对其进行诱导表达,表达出的蛋白经鉴定符合预期条带大小后对其进行纯化复性。结果显示:转化后的菌液经IPTG在37℃下诱导后,SDS-PAGE以及Western Blot结果显示,符合AvBD-11蛋白理论大小为11 k Da的预期,证明AvBD-11成熟肽基因在大肠杆菌中获得成功表达,并以包涵体形式存在。2.AvBD-5、AvBD-11蛋白对H9N2型禽流感的抗病毒作用的研究进行体外试验时,试验分组为:空白对照组,H9N2型禽流感病毒组,AvBD-5蛋白组,AvBD-11蛋白组,AvBD-5蛋白+病毒组,AvBD-11蛋白+病毒组,AvBD-5蛋白+AvBD-11蛋白组,AvBD-5蛋白+AvBD-11蛋白+病毒组,通过CCK方法选出蛋白的最适浓度对鸡胚成纤维细胞（CEF）毒性影响最小,使细胞活性最高。并通过实时荧光定量PCR检测试验组中能否抑制病毒RNA的复制。体内试验分组情况与体外试验情况相同,对已攻毒成功的试验鸡相隔一周加入两次蛋白,设置蛋白组作为对照组,当接种完第二次蛋白后两天对鸡进行剖杀,测定免疫器官指数、外周血淋巴细胞的数量和荧光定量PCR测定病毒相对表达量三项指标。结果显示:免疫器官及其他器官指数结果表明病毒组中胸腺、脾脏、法氏囊、肺脏、心脏指数高于其他组（P（27）0.05）,加入蛋白后能使各项器官指数恢复正常比值,并且混合加入两种蛋白能够起到协同抗感染作用。在对外周血淋巴细胞的测定结果分析中发现,病毒组CD4+T淋巴细胞数量均高于其他组,出现显著性差异,而CD8+T淋巴细胞数量每个组间数值均未出现较大差异,该结果表明加入H9N2型禽流感后仅引起CD4+T淋巴细胞数量的上升,数值变化与前期一些研究情况相吻合。荧光定量PCR中,试验组鸡经剖杀后将组织研磨,提取其RNA进行qPCR,结果表明AvBD-5、AvBD-11均可抑制H9N2型禽流感病毒的复制,具有抵抗感染效果,并且AvBD-5蛋白+AvBD-11蛋白+病毒组其抑制效果再次说明了混合蛋白的协同作用。
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