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研究背景及目的:糖尿病肾脏病（DKD）是糖尿病最严重的微血管并发症之一,全球范围内患病率约20%～40%。据统计,约80%的1型糖尿病和20%～40%的2型糖尿病伴微量白蛋白尿患者在15年内发展为DKD,最终进展至终末期肾脏病（ESRD）。DKD早期改变包括肾小球肥大、肾小球高滤过以及微量白蛋白尿,继而出现肾小球基底膜增厚、系膜基质聚积、肾小管间质纤维化、足细胞损伤和丢失。随着对足细胞的研究不断深入发现,足细胞损伤、功能改变及凋亡与DKD中白蛋白尿的形成和肾小球硬化密切相关。足细胞损伤是DKD发展的关键,故有研究认为DKD的本质就是足细胞病。近年来,体内和体外实验均证实线粒体功能障碍参与足细胞损伤,其相互关系主要表现在以下三个方面:（1）ROS生成增加导致足细胞受损;（2）受损mtDNA累积导致足细胞损伤;（3）呼吸链功能破坏导致足细胞受损;Sestrins是一类在应激条件下产生的高度保守的蛋白家族,其成员Sestrin2通过激活AMPK、抑制mTOR、激活自噬和抗细胞凋亡等途径提供细胞保护作用。近年的研究发现Sestrin2-AMPK信号通路参与心肌和骨骼肌细胞内线粒体生物学发生和线粒体稳态的维持,该信号通路的激活可以保护线粒体抵抗氧化应激造成的损伤,而Sestrin2是否参与调控高糖诱导的足细胞线粒体损伤目前尚不明确。因此,本研究拟通过建立糖尿病大鼠模型和高糖环境下体外培养足细胞来研究线粒体形态、功能改变及Sestrin2-AMPK信号通路;通过分别转染Sestrin2过表达质粒和Sestrin2 siRNA,应用AMPK激动剂或抑制剂来分析足细胞Sestrin2-AMPK信号通路对高糖诱导的足细胞线粒体功能和凋亡的影响,并进一步探讨Sestrin2-AMPK信号通路参与足细胞损伤的分子机制,为DKD的诊断和治疗提供新的方向。方法:第一部分:12只体重200-250g的SPF级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为糖尿病组和正常组,糖尿病组大鼠是以80mg/kg的标准将溶于柠檬酸盐缓冲液中的链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）腹腔注射,对照组大鼠仅注射柠檬酸盐缓冲液。常规通过尾静脉采血测量血液中葡萄糖含量,血糖值＞200mg/dl即为造模成功。STZ注射12周后收集24小时尿液用于检测尿蛋白含量,测量肌酐,称量体重然后采用二氧化碳吸入法处死动物并收集肾脏组织标本。部分样本用4%多聚甲醛固定储存,部分样本用戊二醛固定,剩余储存在-80℃冰柜。HE染色和PAS染色观察两组大鼠肾脏病理变化;组织免疫荧光检测Sestrin2在两组大鼠肾小球内的分布和表达;过筛法分离肾小球并提取蛋白,蛋白免疫印迹观察两组大鼠肾小球Sestrin2、p-AMPK和t-AMPK表达改变;应用透射电子显微镜观察足细胞超微结构和线粒体形态结构的变化;第二部分:体外培养条件永生化人足细胞,分为不同葡萄糖浓度（5、15、25、35mM）刺激24h组和高糖（35mM）刺激不同时间（0、6、12、18、24）组,收集各组细胞,蛋白免疫印迹检测Sestrin2表达改变;体外培养的条件永生化人足细胞随机分为正常对照组、高渗（5mM葡萄糖+30mM甘露醇）组和高糖（35mM葡萄糖）刺激组,免疫荧光观察各组Sestrin2的表达改变;免疫蛋白疫印迹观察各组Sestrin2、p-AMPK和t-AMPK的表达改变;流式细胞术检测各组细胞凋亡改变;应用透射电子显微镜观察各组线粒体形态结构的变化;DCFH-DA荧光探针观察各组细胞内ROS生成变化;JC-1试剂盒用于检测各组线粒体跨膜电位变化;第三部分:体外培养条件永生化人足细胞分为（1）正常对照组、（2）空转质粒组、（3）Sestrin2 siRNA转染组、（4）高糖刺激组、（5）高糖刺激+空载质粒组、（6）高糖刺激+Sestrin2高表达质粒组,蛋白免疫印迹检测各组Sestrin2、p-AMPK和t-AMPK的表达改变;流式细胞术检测各组细胞凋亡改变;DCFH-DA荧光探针观察各组细胞ROS生成的变化;JC-1试剂盒用于检测各组线粒体跨膜电位的变化;体外培养条件永生化人足细胞分为（1）正常对照组、（2）高糖刺激组（3）高糖刺激+AICAR（AMPK激动剂）组、（4）高糖刺激+Compound.C（AMPK抑制剂）组,蛋白免疫印记检测各组Sestrin2、p-AMPK和t-AMPK的表达改变;流式细胞术检测各组细胞凋亡改变;DCFH-DA荧光探针观察各组细胞ROS生成的变化;JC-1试剂盒用于检测各组线粒体跨膜电位的变化;结果:第一部分:与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠血糖、ACR和UTP升高、体重降低（p＜0.05）;HE染色和PAS染色表明糖尿病大鼠表现系膜扩张、胞外基质沉积和肾小球硬化的病理改变;免疫荧光和免疫印记结果表明,糖尿病组大鼠肾小球Sestrin2、p-AMPK表达水平相比正常组降低（p＜0.05）;透射电镜显示糖尿病模型大鼠肾小球足细胞足突融合,线粒体肿胀,嵴结构破坏;第二部分:35mM葡萄糖刺激24h足细胞Sestrin2表达降低（p＜0.05）;免疫荧光和免疫印记证明高糖刺激引起足细胞Sestrin2和p-AMPK的表达水平降低（p＜0.05）,与渗透压无关;透射电镜表明高糖刺激的足细胞线粒体肿胀,内部结构紊乱;高糖刺激引起足细胞凋亡率上升、ROS生成增多,而线粒体跨膜电位下降（p＜0.05）;第三部分:应用Sestrin2 siRNA沉默Sestrin2表达后,与正常对照组相比,p-AMPK表达降低（p＜0.05）,且细胞凋亡率升高、ROS生成增多、线粒体跨膜电位下降（p＜0.05）;高糖刺激的足细胞经转染Sestrin2高表达质粒后,p-AMPK表达增高、足细胞凋亡率下降,ROS生成降低、线粒体跨膜电位升高（p＜0.05）;AMPK激动剂AICAR可以降低细胞凋亡率、减少ROS的生成、提高线粒体跨膜电位,而AMPK抑制剂Compound.C则作用相反（p＜0.05）;结论:高糖刺激抑制足细胞Sestrin2-AMPK信号通路,导致细胞和线粒体损伤;活化该信号通路可以减轻高糖诱导的足细胞和线粒体损伤;反之,抑制该信号通路可加重高糖诱导的足细胞和线粒体损伤。